LỜI NÓI ðẦU Trong những năm cuối của thế kỷ XX và ñầu thế kỷ XXI loài người ñã và ñang chứng kiến những thành tựu to lớn do các ngành công nghệ mũi nhọn (Công nghệ tin học, Công nghệ sinh học, Công nghệ vật liệu mới, Công nghệ năng lượng mới) ñem lại. Trong số các ngành công nghệ mũi nhọn Công nghệ sinh học (Biotechnology) là ngành công nghệ ñầy hứa hẹn. Nền tảng của công nghệ sinh học dựa trên các thành tựu của Hoá sinh học, Di truyền học, Sinh học tế bào. Hoá sinh học – Môn khoa học ra ñời vào nửa cuối thế kỷ XIX. Trong thế kỷ XX Hoá sinh học ñã phát triển mạnh mẽ, ñạt ñược trình ñộ cao trong mọi lĩnh vực nhất là trong lĩnh vực Protein và Nucleic acid cùng các môn khoa học sinh học khác hình thành lĩnh vực Công nghệ sinh học. Ngày nay loài người ñã có ñủ cơ sở ñể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi có tính chống chịu ñối với các tác nhân gây bệnh, có tính chống chịu ñối với ñiều kiện môi trường bất lợi, có phẩm chất`mong muốn …, các giống vi sinh vật có khả năng tạo ra các sản phẩm thực phẩm, các phụ gia thực phẩm ñặc biệt mà công nghệ truyền thống không thể tạo ra hoặc với phẩm chất không cao, các vacxin chữa bệnh ñặc trị … Do vậy kiến thức hoá sinh học là rất cần thiết cho các kỹ sư nông nghiệp, lâm nghiệp, cử nhân sinh học, kỹ sư công nghệ thực phẩm … tương lai. Trong quá trình nâng cao chất lượng ñào tạo ñại học ñến nay Bộ giáo dục và ðào tạo ñã xây dựng thống nhất Chương trình khung ñào tạo các chuyên ngành. Trên cơ sở khung chương trình của môn học Hoá sinh ñại cương chúng tôi mạnh dạn biên soạn giáo trình “Hoá sinh ñại cương”. Giáo trình ñược biên soạn trên cơ sở kinh nghiệm giảng dạy môn học nhiều năm của tập thể cán bộ giảng dạy của Bộ môn Hoá sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Bộ môn Sinh lý – Hoá sinh ñộng vật, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và cập nhật các kiến thức mới của Hoá sinh hiện ñại. Giáo trình ñược phân công biên soạn như sau: - PGS.TS Ngô Xuân Mạnh : Mở ñầu, Chương 4 và 8 - ThS Lại Thị Ngọc Hà : Chương 1 và 5 - TS ðặng Thái Hải : Chương 2,3, 6 và 7 - TS Nguyễn Văn Kiệm : Chương 7 Giáo trình này là tài liệu học tập của sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh của các chuyên ngành nông nghiệp thuộc các trường ðại học Nông nghiệp. Ngoài Giáo trình là tài liệu tham khảo tốt cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh các ngành sinh học, các cán bộ giảng dạy, cán bộ nghiên cứu và các nhà sản xuất trong lĩnh vực nông nghiệp, lâm nghiệp, sinh học, công nghệ thực phẩm … ðây là lần ñầu tiên biên soạn theo nội dung khung chương trình mới, chắc chắn còn nhiều khiếm khuyết. Chúng tôi mong nhận ñược sự ñóng góp ý kiến của người ñọc nhất là các bạn sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ñể Giáo trình ngày càng hoàn thiện và tốt hơn. Tháng 12 năm 2009 Các tác giả Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… i MỤC LỤC Lời nói ñầu Mục lục Mở ñầu Chương 1 1.1 1.1.1 1.1.2 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.5 1.5.1 1.5.2 Chương 2 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 Chương 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.2 3.2.1 PROTEIN KHÁI NIỆM ðịnh nghĩa Chức năng sinh học CẤU TẠO PROTEIN Thành phần nguyên tố Aminoacid – ñơn vị cấu tạo cơ sở của protein Các tính chất của aminoacid CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN Peptide và thuyết polypeptide Cấu trúc bậc một của protein Cấu trúc bậc hai của protein Cấu trúc bậc ba của protein Cấu trúc bậc bốn của protein TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN Hình dạng và kích thước Tính chất lưỡng tính Tính chất bị biến tính Các phản ứng ñặc trưng PHÂN LOẠI PROTEIN Phân loại dựa vào ñộ hòa tan Phân loại dựa vào cấu tạo Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo VITAMIN ðẠI CƯƠNG VỀ VITAMIN CÔNG THỨC CẤU TẠO VÀ CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA VITAMIN Vitamin tan trong chất béo Vitamin tan trong nước Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo ENZYME CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN Sự xúc tác Enzyme là chất xúc tác sinh học ðơn vị hoạt lực của enzyme CẤU TẠO CỦA ENZYME Phần lớn các enzyme có bản chất là protein Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… i ii 1 7 7 7 7 10 10 10 13 18 18 20 21 24 25 26 26 27 28 29 31 31 32 33 33 34 34 35 35 40 45 45 46 46 47 47 48 48 48 ii 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.3 3.4 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.6 Chương 4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.2 4.2.1 4.2.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.4 Chương 5 5.1 5.1.1 5.1.2 5.2 5.2.1 5.2.2 Các cofactor Trung tâm hoạt ñộng của enzyme Các tổ hợp ña enzyme và các enzyme dị lập thể Sự phân bố và các dạng enzyme TÍNH ðẶC HIỆU CỦA ENZYME CƠ CHẾ HOẠT ðỘNG CỦA ENZYME CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất và enzyme. ðộng học của phản ứng enzyme Ảnh hưởng của nhiệt ñộ Ảnh hưởng của pH môi trường Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá và chất ức chế CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI ENZYME Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo NUCLEIC ACID THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA NUCLEIC ACID Các base chứa nitơ ðường pentose Nucleoside Nucleotide CẤU TẠO CỦA CÁC NUCLEIC ACID Cấu tạo DNA Cấu tạo của RNA SINH TỔNG HỢP NUCLEIC ACID Sinh tổng hợp nucleotide dạng purine Sinh tổng hợp các nucleotide kiểu pyrimidine Sinh tổng hợp các nucleotide thymidine Sinh tổng hợp các deoxyribonucleotide Sinh tổng hợp DNA (sự tái bản DNA - Replication) Sinh tổng hợp RNA ( sự phiên mã-Transcription) PHÂN GIẢI CÁC NUCLEIC ACID Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo SỰ TRAO ðỔI AMINOACID VÀ PROTEIN SỰ TRAO ðỔI AMINOACID Sự tổng hợp aminoacid Sự biến ñổi các aminoacid SỰ TRAO ðỔI PROTEIN Sự tổng hợp protein Sự phân giải protein Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 49 53 54 55 57 58 60 60 63 63 64 65 66 67 68 68 68 71 71 71 73 73 76 78 78 80 80 81 81 85 90 90 90 91 91 91 93 96 96 107 108 108 iii Chương 6 6.1 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.3 6.3.1 6.3.1 6.4 6.4.1 6.4.2 6.5 6.5.1 6.5.2 6.5.3 6.6 6.6.1 6.6.2 6.7 6.7.1 6.7.2 6.7.3 6.7.4 6.7.5 Chương 7 7.1 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.3 7.3.1 7.3.2 CARBOHYDRATE ðẠI CƯƠNG VỀ CARBOHYDRATE ðịnh nghĩa Chức năng của carbohydrate Phân loại CÁC MONOSACCHARIDE ðịnh nghĩa ðồng phân quang học của monosaccharide Cấu trúc dạng vòng Các dẫn xuất của hexose Một số monosaccharide quan trọng OLIGOSACCHARIDE ðịnh nghĩa Một số oligosaccharide phổ biến POLYSACCHARIDE Polysaccharide thuần Polysaccharide tạp SỰ TỔNG HỢP CARBOHYDRATE Sơ lược về hoá sinh quang hợp Tổng hợp disaccharide và tinh bột Tổng hợp glucose từ các sản phẩm chuyển hoá trung gian SỰ PHÂN GIẢI CÁC POLYSACCHARIDE Sự phân giải glycogen Sự phân giải tinh bột HOÁ SINH HÔ HẤP Quá trình ñường phân (Glycolysis) Các ñường hướng chuyển hoá của pyruvate Chu trình citric acid Sự phosphoryl hoá ôxy hoá Chu trình pentose phosphate Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo LIPID ðẠI CƯƠNG VỀ LIPID Khái niệm về lipid Chức năng sinh học của lipid Phân loại lipid CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT CỦA LIPID Acid béo và alcol Cấu tạo và tính chất của lipid ñơn giản Cấu tạo và tính chất của các lipid phức tạp SỰ PHÂN GIẢI LIPID Sự phân giải triacylglycerol Phân giải các lipid phức tạp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 109 110 110 110 110 110 110 111 111 112 113 113 113 114 114 114 116 118 118 127 131 131 131 132 133 133 138 141 144 146 149 149 150 150 150 150 151 152 152 154 155 158 158 167 iv 7.4 7.4.1 7.4.2 Chương 8 8.1 8.2 TỔNG HỢP LIPID Tổng hợp triacylglycerol Sinh tổng hợp Glycerophospholipid và Sphingolipid Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo TRAO ðỔI CHÂT VÀ NĂNG LƯỢNG CỦA CÁC CƠ THỂ SỐNG Trao ñổi chất Trao ñổi năng lượng Câu hỏi ôn tập Tài liệu tham khảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 167 167 174 177 177 178 178 180 181 181 v MỞ ðẦU Hoá sinh học (Biochemistry) là một môn khoa học nghiên cứu thành phần hoá học của cơ thể và những chuyển biến hoá học của các chất và của năng lượng xảy ra trong quá trình hoạt ñộng sống của con người, ñộng vật, thực vật và vi sinh vật. Việc nghiên cứu các chất có trong thành phần của cơ thể sinh vật là nhiệm vụ của tĩnh hoá sinh (Static biochemistry). Tĩnh hoá sinh có quan hệ rất mật thiết với hoá học hữu cơ (Organic chemistry). Việc nghiên cứu các chuyển hoá hoá học xảy ra trong quá trình hoạt ñộng sống của cơ thể nghĩa là nghiên cứu về mặt hoá học của sự trao ñổi chất là nhiệm vụ của ñộng hoá sinh (Dynamic biochemistry). Cần nhấn mạnh rằng tĩnh hoá sinh và ñộng hoá sinh liên quan liên quan với nhau rất chặt chẽ- việc nghiên cứu các quá trình hoá sinh học sẽ vô nghĩa nếu không có sự nghiên cứu các chất tham gia trong quá trình này. Hoá sinh mới trở thành một ngành khoa học ñộc lập vào nửa sau thể kỷ thứ XIX, mặc dầu ngay từ thời thượng cổ, con người ñã làm quen với nhiều quá trình hoá sinh học trong cuộc sống hàng ngày của họ (nướng bành mỳ, nấu rượu, thuộc da…) Sự cố gắng làm tăng năng suất mùa màng trên ñồng ruộng và sử dụng các thực vật khác nhau ñể làm thức ăn, làm thuốc, làm sơn, làm vải… ñã khiến con người phải nghiên cứu các cấu tử của thực vật và sự ảnh hưởng của các chất khác nhau ñối với sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Việc ñấu tranh với bệnh tật ñã khiến con người phải nghiên cứu các quá trình xảy ra trong cơ thể người ốm và người khoẻ cũng như ảnh hưởng của các dược liệu khác nhau lên cơ thể con người. Sự phát triển khoa học ở cuối thể kỷ XVIII- ñầu thể kỷ XIX ñã cho phép người ta chiết xuất ñược từ thực vật hàng loạt acid hữu cơ (malic acid, oxalic acid, citric acid, lactic acid …) và glycerol. Khi oxy hoá ñường, người ta ñã thu ñược formic acid. Vole F. (Friedrich Wohler, 1828) ñã tổng hợp ñược ure; ñiều này chứng tỏ có thể tổng hợp ñược chất hữu cơ của cơ thể sống mà không cần “lực sống”. Trong thời gian này, Lavoaziê (Lavoisier) cũng ñã giải thích ñược cơ chế hoá học của sự hô hấp và sự cháy; ông ñã xác nhận rằng khi hô hấp trong cơ thể carbon và hydrogen bị oxy hoá từ từ; quá trình này giống sự cháy bình thường. Vào cuối thế kỷ XVIII, người ta ñã có những nhận xét và phát hiện ñầu tiên có tính chất khoa học về sự tác dụng của các ezyme. Ví dụ, người ta ñã chứng minh ñược rằng trong hạt lúa mì nảy mầm chứa một chất có khả năng biến tinh bột thành ñường và dextrin và sau ñó người ta ñã chiết xuất ñược chất này từ mạch nha và goi là amylase. Người ta cũng ñã mô tả về enzyme pepsin. Ở thế kỷ XIX, các nhà khoa học ñã ñạt ñược những thành tựu to lớn trong lĩnh vực tĩnh hoá sinh và trong việc nghiên cứu sự trao ñổi chất ở trong cơ thể sinh vật. Bằng cách sử dụng các phương pháp nghiên cứu mới, Liebig ñã xác ñịnh thành phần của nhiều thực phẩm, ñã chia các chất chứa trong thực phẩm thành protein, glucid, lipid và xác ñịnh hàm lượng nitơ trong protein. Các kết quả quan trọng trong việc nghiên cứu cơ chế hoá học của protein ñã thu ñược nhờ các công trình của N.E.Liascopski và A.Ia.Danilepski. Năm 1884, Danilepski lần ñầu tiên ñã ñiều chế ñược các chất giống protein nhờ enzyme. Sau ñó, Fise (Fischer) ñã tổng hợp ñược hàng loạt polypeptid. Năm 1880, N.I.Lunin ñã phát hiện ra vitamin. Việc xác lập nên thành phần hoá học của cơ thể sống, việc phát hiện ra các enzyme và việc làm sáng tỏ vai trò của chúng trong sự trao ñổi chất, sự phát hiện ra vitamin và hormon, sự phát triển của hoá học về amionoacid và protein, về glucid, lipid ñã tạo ñiều kiện cho việc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 1 hình thành ñộng hoá sinh. ðồng thời chính nhờ sự phát triển của ñộng hoá sinh mà người ta ñã xác ñịnh ñược những quan ñiểm thống nhất về các quy luật chung của các quá trình trao ñổi chất và những chuyển hoá năng lượng trong cơ thể sinh vật. Sơ ñồ lịch sử phát triển Hoá sinh học Như trên ñã nói, Hoá sinh học ñã trở thành một khoa học ñộc lập ở nửa sau của thế kỷ XIX. Nó ñã ñược phát triển trên cơ sở của những thành tựu của hoá học hữu cơ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 2 Hoá sinh học nghiên cứu những giai ñoạn riêng biệt của quá trình trao ñổi chất, nghiên cứu mối liên quan tương hỗ và sự phụ thuộc lẫn nhau của các quá trình này; hoá sinh học nghiên cứu vai trò sinh lý của các chất riêng lẻ trong sự sống của cơ thể, nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp của chất hữu cơ phức tạp từ những chất ñơn giản cũng như nghiên cứu những chuyển hoá sinh ñịa hoá học của xác ñộng vật và thực vật. Nhiệm vụ quan trọng nhất của hoá sinh học là phát hiện cấu trúc và tổng hợp bằng con ñường nhân tạo các chất protein và nucleic acid tức là những chất mang sự sống. Vấn ñề về mối liên quan của các qúa trình trao ñổi chất với các chức năng sinh lý khác nhau của cơ thể cũng là một vấn ñề quan trọng của hoá sinh học hiện ñại. Tuỳ theo ñối tượng nghiên cứu mà người ta chia hoá sinh học thành hoá sinh ñại cương, hoá sinh thực vật, hoá sinh ñộng vật, hoá sinh vi sinh vật và y hoá sinh. Hoá sinh học có một ý nghĩa thực hành to lớn ñối với y học, nông nghiệp và hàng loạt ngành công nghiệp khác. Việt Nam ñang trong thời kỳ phát triển, cùng với các ngành khoa học cơ bản (toán, lý, hoá, sinh…) và các ngành khoa học cơ sở khác (di truyền, sinh lý, vi sinh vật…), hoá sinh học phải căn cứ trên những phương hướng và nhiệm vụ cụ thể nhằm phục vụ kịp thời và có hiệu quả những ñòi hỏi nóng bỏng của sản xuất nông lâm ngư nghiệp cũng như của y tế và quốc phòng. Trong thế kỷ XXI các nhà hóa sinh học Việt Nam bằng những công trình nghiên cứu của bản thân mình và bằng cách áp dụng những thành tựu của hoá sinh học hiện ñại của thế giới có chọn lọc và sáng tạo, sẽ ñủ khả năng giải quyết những vấn ñề do thực tiễn của sản xuất và ñời sống nước ta ñặt ra, sẽ góp phần xứng ñáng của mình trong sự nghiệp công nghiệp hoá, hiện ñại hoá nông nghiệp và nông thôn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 3 NHỮNG SỰ KIỆN CHÍNH TRONG LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN MÔN HOÁ SINH HỌC 1770 – 1774 – Priestley chứng minh cây thải oxygen và ñộng vật sử dụng nó. 1773 – Rouelle phân lập ñược urea từ nước tiểu. 1828 – Wohler tổng hợp chất hữu cơ ñầu tiên là urea từ chất vô cơ. 1838 – Schleiden và Schwann ñưa ra giả thuyết về cấu tạo tế bào của cơ thể sống. 1854 – 1864 – Pasteur chứng minh sự lên men nhờ vi sinh vật. 1864 – Hoppe – Seyler nhận ñược tinh thể hemoglobin. 1866 – Mendel ñưa ra quy luật phân ly ñộc lập và tổ hợp tự do của các allele ở ñậu. 1893 – Ostwald chứng minh bản chất xúc tác của enzyme. 1898 – Camillo Golgi – phát hiện bộ máy Golgi. 1905 – Knoop tìm ra cơ chế oxyhoá - β phân hoá acid béo. 1907 – Fletcher và Hopkins chứng minh lactic acid hình thành từ glucose trong sự co bóp cơ ở ñiều kiện yếm khí. 1910 – Morgan ñề ra học thuyết di truyền nhiễm sắc thể. 1912 – Warburg phát hiện enzyme tham gia quá trình hô hấp. 1913 – Michaelis và Menten xây dựng lý thuyết ñộng học xúc tác của enzyme. 1922 – Mc Collum chứng minh sự thiếu vitamin D là nguyên nhân gây bệnh còi xương. 1926 – Summer lần ñầu nhận ñược tinh thể urease. 1926 – Jasen và Donath tách vitamin B1 (thiamine) từ cám gạo. 1926 – 1930 – Svedberg chế tạo thiết bị siêu li tâm ñầu tiên. 1928 – Levene chứng minh nucleotide là ñơn vị cấu tạo của nucleic acid. 1928 – Szent – Gyorgyi phân lập vitamin C (ascorbic acid). 1928 – 1933 – Warburg chứng minh pophyrin chứa Fe có mặt trong chuỗi hô hấp. 1929 – Burr và Burr phát hiện linoleic acid là acid béo thiết yếu ñối với ñộng vật. 1931 – Englehardt phát hiện bản chất song hành liên hợp của quá trình phosphoryl hoá và hô hấp. 1932 – Warburg va Christian tìm ra “enzyme màu vàng” là flavoprotein. 1933 – Krebs và Henseleit phát hiện ra chu trình urea. 1933 – Embden và Meyerhof tìm ra các chất trung gian của quá trình glycolysis. 1935 – Schoenheimer và Rittenberg lần ñầu tiên sử dụng ñồng vị trong nghiên cứu trao ñổi chất. 1935 – Stanley nhận ñược tinh thể virus bệnh khảm thuốc lá (TMV). 1937 – Krebs phát hiện chu trình citric acid. 1937 – Warburg giải thích sự hình thành ATP xẩy ra song hành liên hợp với việc glyceraldehyde – 3 – phosphate bị mất hydrogen. 1938 – Hill chứng minh dịch vô bào chứa lục lạp thể tạo oxygen khi ñược chiếu sáng. 1939 – C.Cori và G.Cori tìm ra hoạt tính xúc tác ñảo chiều của glycogen phossphorylase. 1939 – Lipmann chứng minh vai trò trung tâm của ATP trong chu trình năng lượng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 4 1939 – 1946 – Szent – Gyorgyi phát hiện phức actin – myosin. 1940 – Beadle và Tatum nêu giả thuyết quan hệ một gene một enzyme. 1942 – Bloch và Rittenberg phát hiện acetate là tiền chất tạo cholesterol. 1944 – Avery, Mac Leofd và Mc Carty chứng minh DNA là nguyên nhân biến nạp ở vi khuẩn. 1947 – 1950 – Lipmann và Kaplan tách và ñịnh tính CoA. 1948 – Leloir phát hiện vai trò uridine nucleotide trong chuyển hoá cacbohydrate. 1948 – Hogeboom, Schneider và Palade tách phân ñoạn tế bào bằng phương pháp li tâm. 1949 – Christian de Duve phát hiện ra lysosome. 1950 – 1953 – Chargaff phát hiện sự tương ứng của các gốc trong DNA. 1951 – Pauling và Corey ñưa ra mô hình ñường xoắn ỏ của ỏ-keratin. 1952 – 1954 – Zamecnick xây dung hệ thống nghiên cứu tổng hợp protein vô bào. 1953 – Vigneaud tổng hợp hormone ñầu tiên là oxytocin. 1953 – Sanger và Thompson xác ñịnh thứ tự amino acid của insulin. 1953 – Watson, Crick và Wilkins xây dung mô hình xoắn ñôi DNA. 1954 – Hugh Huxley trình bày mô hình sợi trượt của quá trình co cơ. 1956 – Kornberg phát hiện DNA polymerase. 1956 – Anfinsen và White khẳng ñịnh thứ tự sắp xếp amino acid ñặc hiệu quyết ñịnh cấu trúc không gian của phân tử protein. 1957 – Hoagland, Zamecnik và Stephenson tách và xác ñịnh choc năng tDNA. 1957 – Sutherland phát hiện AMP vòng. 1958 – Weiss, Hurwitz và Stevens phát hiện enzyme RNA polymerase phụ thuộc DNA. 1958 – Meselson và Stahl chứng minh DNA nhân ñôi theo cơ chế bán bảo tồn. 1959 – Wakil và Ganguly chứng minh malonyl – CoA là chất trao ñổi trung tâm trong tổng hợp acid béo. 1959 – Krebs và Fischer phát hiện ra protein kinase. 1960 – Kendrew thông báo về phân tích tán xạ X quang cấu trúc myoglobin. 1961 – Jacob, Monod ñưa ra lý thuyết về operon. 1961 – Jacob, Monod và Changeux nêu giả thuyết về cơ chế tác ñộng của enzyme dị lập thể (allosteric enzyme). 1961 – Mitchell trình bày cơ chế hoá thẩm tạo ATP nhờ oxy hoá phosphorylhoá. 1961 – Nirenberg và Matthaei phát hiện polyuridylic acid là mã di truyền của polyphenylalanine. 1962 – Racker tách F1 ATPase từ ti thể. 1966 – Crick ñưa ra giả thuyết về liên kết “wobble”. 1966 – Gilbert và Muller-Hill tách thành công lac repressor. 1968 – Meselson và Yuan phát hiện enzyme DNA restrictase ñầu tiên. 1970 – Temin và Baltimore phát hiện enzyme reverse transcriptase. 1972 – Singer và Nicolson ñề xướng mô hình cấu trúc màng khảm. 1973 – Cohen, Chang, Boyer và Helling thực hiện việc nhân dòng DNA. 1975 – Sanger và Barrell ñề ra phương pháp xác ñịnh nhanh thứ tự nucleotide DNA. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 5 1977 – Starlinger lần ñầu tiên phát hiện ñoạn DNA gắn xen hàng. 1978 – Tonegawa tìm ra cơ chế cắt DNA dư trong quá trình hình thành gene immunoglobulin. 1981 – Steitz xác ñịnh cấu trúc CAP protein. 1983 – Mullis ñề ra kỹ thuật nhân nhanh DNA – Phản ứng nhân sợi polymerase PCR (polymerase chain reaction). 1984 – Michel, Deisenhofer và Huber xác ñịnh cấu tâm phản ứng quang hợp. 1984 – Blobel phát hiện cơ chế chuyển vị trí protein xuyên màng. 1988 – Elison và Hitching tổng hợp và sử dụng purine và pyrimidine trong hoá trị liệu. 1989 – Synder tinh sạch và cải biến thụ thể (receptor) của inositol – 1,3,4 – P3. 1994 – Gilman và Rodbell phát hiện G – protein và vai trò chuyển tín hiệu nội bào của nó. 1995 – Lewis, Nusslein – Volhard và Wieschaus phát hiện cơ chế kiểm soát di truyền giai ñoạn phát triển phôi Drosophila ñầu tiên. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 6 Chương1 PROTEIN Tóm tắt: Protein – nhóm hợp chất cao phân tử thực hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng. Phân tử protein cấu tạo từ 20 aminoacid. Các phân tử protein cấu tạo từ một hoặc vài mạch polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein là số lượng và trình tự sắp xếp của aminoacid. Cấu trúc bậc hai của protein là xoắn α hay nếp gấp β. Cấu trúc bậc ba là cấu trúc không gian của protein. ðại bộ phận protein khi có cấu trúc bậc ba thực hiện ñược chức năng sinh học. Cấu trúc bậc bốn của protein là sự kết hợp vài tiểu ñơn vị vốn có cấu trúc bậc ba ñể tạo nên phân tử protein thực hiện ñược chức năng sinh học. Protein có khối lượng phân tử cao, tính hấp phụ bề mặt và dễ bị biến tính, tính lưỡng tinh và các phản ứng hoá học ñặc trưng. Dựa vào thành phần cấu tạo protein ñược chia thành protein ñơn giản và protein phức tạp. 1. 1. KHÁI NIỆM Thuật ngữ protein bắt nguồn từ tiếng Hy lạp“proteios“ có nghĩa là quan trọng nhất hay chiếm vị trí thứ nhất. Trên thực tế, protein là loại hợp chất vô cùng quan trọng của tế bào sống cả về mặt lượng và về mặt chất bởi lẽ ngoài vai trò cấu trúc tế bào (protein chiếm hơn nửa khối lượng khô tế bào), protein còn ñảm nhận rất nhiều chức năng sinh học quan trọng, ñảm bảo cho sự hoạt ñộng và phát triển bình thường của tế bào. 1.1.1. ðịnh nghĩa Protein là các hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử lớn, mạch thẳng, ñược cấu tạo từ các α-aminoacid liên kết với nhau bằng liên kết peptide (-CO-NH-), bị kết tủa bởi dung dịch trichloroacetic acid 10%. Các phân tử protein có thể ñược cấu tạo từ một hoặc từ nhiều chuỗi polypeptide. Công thức cấu tạo tổng quát của chuỗi polypeptide như sau: H 2N CH C N CH C ... N CH C R1 O H R2 O H Rn O OH n Trong ñó các Ri là các mạch bên của aminoacid. 1.1.2. Chức năng sinh học Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sinh vật. Các chức năng quan trọng của protein ñược kể ñến sau ñây. a. Chức năng xúc tác Hầu hết các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống từ các phản ứng ñơn giản nhất như phản ứng hydrat hóa, decarboxyl hóa ñến các phản ứng của các quá trình phức tạp như sao mã, dịch mã ñều ñược xúc tác bởi các enzyme. Các biến ñổi hóa học in vivo rất hiếm khi xảy ra với tốc ñộ có thể nhận thấy ñược khi không có mặt của enzyme. Các enzyme ñều có bản chất hóa học là protein do ñó protein ñược coi là trung tâm của hầu hết biến ñổi xảy ra trong cơ thể sống, ñảm bảo sự chuyển hóa các chất xảy ra bình thường trong cơ thể. Chức năng này của protein sẽ ñược trình bày cụ thể ở chương enzyme. b. Chức năng vận chuyển Nhiều protein ñóng vai trò là các „xe tải“ vận chuyển các chất trong cơ thể. Hemoglobine, myoglobine (ở ñộng vật có xương sống), hemoxiamine (ở ñộng vật không xương sống) kết hợp với oxi rồi vận chuyển oxi theo máu ñến khắp các mô và cơ quan trong cơ thể. Nhờ các chất Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………7 vận chuyển này mà mặc dù oxi có ñộ hòa tan trong nước thấp, chúng vẫn ñược chuyển ñến và thỏa mãn ñược nhu cầu oxi của các cơ quan trong cơ thể. Sắt ñược vận chuyển trong huyết tương nhờ transferrine, một protein và ñược dự trữ ở dạng phức với ferritine, một protein khác. Các lipoprotein, một loại protein phức tạp ñóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển lipid trong cơ thể. Lipid không tan trong nước nhưng sau khi kết hợp với protein tạo lipoprotein, phần lipid kị nước bị cuộn vào trong, phần protein ưa nước tạo thành vỏ bọc bên ngoài do ñó lipid có thể ñược vận chuyển trong môi trường nước ví dụ như máu. Trong huyết tương có một số lipoprotein khác nhau về tỷ trọng có vai trò khác nhau trong quá trình vận chuyển lipid: chylomicron có tỷ trọng nhỏ hơn 0.940 vận chuyển triacylglycerol và các lipid khác của thức ăn từ ruột non ñến mỡ, gan; lipoprotein có tỷ trọng 0.940 – 1.006 vận chuyển triacylglycerol ñược tổng hợp trong cơ thể ñến các mô mỡ; lipoprotein có tỷ trọng 1.663 – 1.210 có vai trò vận chuyển cholesterol từ mô ngoại ñến gan. c. Chức năng chuyển ñộng Nhiều protein tham gia trực tiếp vào sự chuyển ñộng như sự co cơ, sự di chuyển của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào. Ở ñộng vật có xương sống, sự co cơ ñược thực hiện nhờ chuyển ñộng trượt lên nhau của hai loại sợi protein: sợi to chứa myosin, sợi nhỏ chứa các protein actin, tropomyosin và troponin. Hình 1-1. Cấu tạo sợi cơ và cơ chế của sự co cơ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………8 Các kháng thể có bản chất glycoprotein ñược cấu tạo từ hai chuỗi nặng và hai cuỗi nhẹ. Hai chuỗi này kết hợp với nhau nhờ các cầu disulfide. Phân tử kháng nguyên gồm có hai vùng: vùng cố ñịnh và vùng thay ñổi. Vùng thay ñổi chính là paratope, vị trí kháng thể kết hợp với kháng nguyên. Vùng này có cấu tạo phù hợp ñể kết hợp ñặc hiệu và vô hoạt kháng nguyên. Các chất kháng virus ñược tổng hợp ở cả tế bào ñộng vật và thực vật. Các interferon là những protein do tế bào ñộng vật có xương sống tổng hợp và tiết ra ñể chống lại sự nhiễm virus. Tác dụng của interferon rất mạnh, ở nồng ñộ 10-11M interferon ñã có hiệu quả kháng virus rõ rệt. Ngoài ra, interferon kết hợp vào màng nguyên sinh chất của các tế bào khác trong cơ thể và cảm ứng trạng thái kháng virus của chúng. Trong các mô thực vật, người ta cũng tìm thấy các chất có bản chất protein có khả năng kìm hãm sự phát triển và ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus. Chúng ñược gọi là các antivirus thực vật. Các protein tham gia quá trình ñông máu có vai trò bảo vệ cơ thể khỏi bị mất máu. Lectin, một loại glycoprotein có nhiều trong các loại ñậu có khả năng kìm hãm sự phân chia các tế bào dị dạng do ung thư do vậy ngăn chặn sự phát triển và lây lan của chúng. Một số loài thực vật ví dụ như ñậu tương có protein kìm hãm protease (Protease-Protein Inhibitor – PPI) có tác dụng kìm hãm protease của nấm mốc và sâu bọ, làm sâu bọ và nấm mốc không phát triển ñược trên các loại nông sản này. e. Chức năng truyền xung thần kinh Một số protein có vai trò trung gian cho phản ứng trả lời của tế bào thần kinh ñối với các kích thích ñặc hiệu. Ví dụ như opsin là protein kết hợp với 11-cis-retinal tạo rhodopsin là chất màu thị giác tham gia quá trình cảm quang ở mắt. Rhodopsin Bóng tối Ánh sáng opsin isomerase 11- Cis retinal 11-trans retinal 11- Cis retinol 11-trans retinol Thức ăn ñộng, thực vật Phân giải không thuận nghịch Hình 1-2. Rhodopsin tham gia quá trình cảm quang ở mắt
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………9 protein ức chế hoặc hoạt hóa các enzyme ñều có chức năng ñiều hòa quá trình trao ñổi chất. Ở sinh vật bậc cao, sự phát triển và chuyên biệt hóa ñược kiểm soát bằng các factor tăng trưởng có bản chất protein. g. Chức năng kiến tạo và chống ñỡ cơ học Các protein ñảm bảo chức năng này thường là các protein sợi như α-keratin của tóc, da, móng tay; collagen, ellastin của mô liên kết, mô xương; fibroin của tơ tằm, tơ nhện. h. Chức năng dự trữ dinh dưỡng Protein là những chất dự trữ quan trọng, cung cấp aminoacid cho phôi phát triển như ovalbumine trong lòng trắng trứng, gliadin trong hạt lúa mỳ, zein trong ngô. 1.2. CẤU TẠO PROTEIN 1.2.1. Thành phần nguyên tố Tất cả các protein ñều chứa các nguyên tố C, H, O, N. Một số còn chứa một lượng nhỏ S. Tỷ lệ khối lượng các nguyên tố này trong phân tử protein như sau: C: 50-55% H: 6.5-7.3% O: 21-24% N: 15-18% (thường là 16%) S: 0-0.24% Ngoài các nguyên tố kể trên, một số protein còn chứa một lượng nhỏ các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca... Tỷ lệ khối lượng của N trong phân tử protein thường là 16% do ñó trong thực tế, ñể xác ñịnh hàm lượng protein của một mẫu vật, người ta xác ñịnh hàm lượng nitơ protein của mẫu vật ñó và nhân với 6.25 (100/16 = 6.25). Chỉ số này sẽ thay ñổi tùy thuộc hàm lượng nitơ trong protein của mẫu (thường nhỏ hơn 6.25 ñối với ngũ cốc, lớn hơn 6.25 ñối với các loại ñậu...). 1.2.2. Aminoacid – ñơn vị cấu tạo cơ sở của protein 1.2.2.1. ðịnh nghĩa Aminoacid là dẫn xuất của acid hữu cơ trong ñó một nguyên tử hydro (ñôi khi là hai) ñược thay thế bởi nhóm amine (-NH2). Nói một cách khác, phân tử aminoacid chứa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và một nhóm amine (-NH2). Tùy thuộc vào vị trí nhóm amine so với nhóm carboxyl mà ta có các acid α, β hay γ-amine. R-CH-COOH R-CH- CH2 -COOH R-CH- CH 2- CH 2-COOH NH2 NH NH 2 2 Acid α-amine Acid β-amine Acid γ-amine Các aminoacid có trong tế bào sinh vật hầu hết ở dạng α-amine. Người ta tìm thấy β-alanine trong coenzyme A, dịch tiết của rễ cây họ ñậu và trong một số peptid ở cơ của một vài loài cá. R ñược gọi là mạch bên của aminoacid. Mạch bên R có thể chứa các nhóm chức như –OH, -SH, COOH, - NH2..., sự có mặt của các nhóm này ảnh hưởng ñến tính chất của các aminoacid cũng như của các protein ñược cấu tạo từ các aminoacid. Các aminoacid cấu tạo protein tự nhiên chỉ khác nhau ở phần mạch bên R. Khi R khác nhau, aminoacid khác nhau. Chính ñiều này tạo nên tính ña dạng của aminoacid. Trong tự nhiên các aminoacid ñược chia thành 2 nhóm: Aminoacid có nguồn gốc protein (gồm 20 aminoacid có trong thành phần cấu tạo protein) và aminoacid tự do. 1.2.2.2. Phân loại aminoacid 20 aminoacid tham gia cấu tạo protein có tên gọi, công thức cấu tạo cũng như ñặc ñiểm và ký hiệu của các aminoacid này ñược giới thiệu ở bảng 1.1. và hình 1-3. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………10 Các aminoacid có thể ñược phân loại theo cấu tạo, theo mức ñộ phân cực và theo giá trị dinh dưỡng. a. Phân loại theo cấu tạo - Aminoacid mạch thẳng + Aminoacid mạch thẳng với mạch bên là hydrocarbon: Glycine, Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine + Aminoacid mạch thẳng với mạch bên chứa nhóm –OH: Serine, Threonine + Aminoacid mạch thẳng với mạch bên chứa lưu huỳnh: Cysteine, Methionine + Aminoacid dicarbocylic và amid của chúng: Acid aspartic, Acid glutamic, Asparagine, Glutamine + Aminoacid kiềm tính: Lysine, Arginine - Aminoacid mạch vòng + Aminoacid mang vòng thơm: Phenylalanine, Tyrosine, Tryptophane + Aminoacid mang dị vòng: Proline, Histidine b. Phân loại theo ñộ phân cực - Nhóm các aminoacid không phân cực: Alanine, Valine, Glycine, Leucine, Isoleucine, Proline. - Nhóm các aminoacid phân cực với chuỗi bên không mang ñiện: Serine, Threonine, Cysteine, Methionine, Asparagine, Glutamine. - Nhóm các aminoacid phân cực với chuỗi bên mang ñiện dương: Lysine, Arginine, Histidine. - Nhóm các aminoacid phân cực với chuỗi bên mang ñiện âm: Acid aspartic, Acid glutamic. - Nhóm các aminoacid với chuỗi bên mang nhân thơm: Phenylalanine, Tyrosine, Tryptophane. Bảng 1-1. Các aminoacid thường gặp trong phân tử protein (Lê Ngọc Tú, 1997) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ðộ tan (g/100g H2O) Glycine 24.99 Alanine 16.51 Leucine 2.19 Isoleucine 4.117 Valine 8.85 Serine 5.023 Threonine 20.50 Aspartic acid 0.5 Glutamic acid 0.843 Lysine Arginine Cysteine Methionine 3.35 Phenylalanine 2.965 Tyrosine 0.045 Tryptophane 1.14 Histidine 4.29 Proline 162.3 Asparagine 3.11 Glutamine 3.6 Tên pI 5.97 6.0 5.98 6.02 5.96 5.68 6.16 2.77 3.22 9.74 10.76 5.07 5.74 5.48 5.66 5.89 7.59 6.3 5.41 5.65 Viết tắt ba chữ Gly Ala Leu Ile Val Ser Thr Asp Glu Lys Arg Cys Met Phe Tyr Trp His Pro Asn Gln Viết tắt một chữ in G A L I V S T D E K R C M P Y W H P B G Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………11 Hình 1-3. Công thức cấu tạo của các aminoacid thường gặp trong phân tử protein
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………12 - Các aminoacid có thể thay thế là các aminoacid còn lại mà cơ thể người và ñộng vật có thể tự tổng hợp ñược. Tuy nhiên khi thiếu các aminoacid này cũng gây rối loạn các quá trình trao ñổi chất . 1.2.3. Các tính chất của aminoacid a. Tính ñồng phân quang học Tất cả các aminoacid trừ glycine ñều có nguyên tử carbon bất ñối C*(nguyên tử carbon gắn với 4 nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử khác nhau) ở vị trí Cα nên mỗi aminoacid ñều có hai ñồng phân quang học D và L hay còn ñược gọi là ñồng phân enantiomer. Hai ñồng phân này giống như vật và ảnh của nó qua một gương phẳng. Chúng có tính chất vật lý và hóa học hoàn toàn giống nhau. ðể xác ñịnh ñồng phân dạng D và L của một aminoacid, người ta so sánh công thức cấu tạo không gian của nó với D và L-glyceraldehyde (Hình 1-4). Vì dạng công thức không gian của aminoacid phức tạp do ñó người ta có thể dùng công thức hình chiếu Fisher ñể xác ñịnh dạng D và L của chúng: nếu nhóm –NH2 nằm phía phải của trục phân tử, aminoacid thuộc dãy D và ngược lại. Hình 1-4. ðồng phân D, L-glyceraldehyde và ñồng phân D, L-aminoacid. Một ñiều cần nhấn mạnh là dạng ñồng phân D và L không liên quan gì ñến khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của aminoacid. Ký hiệu D và L chỉ nói lên vị trí của nhóm amine và nguyên tử hydro tại nguyên tử carbon α. Khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của aminoacid ñược ký hiệu bằng (+) nếu quay sang phải hoặc (-) nếu quay sang trái ngay trước tên của aminoacid (ví dụ L (-) leucine). Khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của aminoacid phụ thuộc vào ñiều kiện môi trường ñặc biệt là pH. Hầu hết các aminoacid tham gia cấu tạo protein tự nhiên ñều ở dạng ñồng phân L. Tuy nhiên, trong một số peptide của vi khuẩn ñặc biệt là các peptide tham gia cấu tạo thành tế bào vi khuẩn hoặc một số peptide kháng sinh, người ta có tìm thấy D-aminoacid (Hình 1-5). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………13 Hình 1-5. Công thức cấu tạo của tyrocidine, hỗn hợp các decapeptide dạng vòng sinh tổng hợp bởi Bacillus brevis tìm thấy trong ñất. Số lượng các ñồng phân quang học của một aminoacid là 2n trong ñó n là số lượng nguyên tử carbon bất ñối trong phân tử. Như vậy, ñối với các aminoacid có nhiều hơn 1 nguyên tử carbon bất ñối, số lượng ñồng phân quang học sẽ lớn hơn hai. Trong trường hợp ñó, dạng L sẽ là dạng ñồng phân quang học có trong protein, dạng D là ảnh của nó qua gương phẳng, các ñồng phân quang học khác ñược gọi là L-allo hoặc D-allo tùy thuộc vào cấu hình nguyên tử Cα của nó. Các ñồng phân quang học của isoleucine ñược giới thiệu ở hình 1-5. Hình 1-5. Các ñồng phân quang học của isoleucine Trong hóa học hữu cơ, ký hiệu L và D thường ñược thay thế bằng S (tiếng latin „Sinistrum“, bên trái) và R (tiếng latin „Rectrum“, bên phải). b. Tính lưỡng tính Tất cả các aminoacid ñều chứa ít nhất hai nhóm ion hóa là nhóm – NH2 và nhóm –COOH. Khi nhóm – COOH phân ly tạo thành ion âm theo phương trình (1): RCOOH ↔ RCOO- + H+ (1) Khi nhóm –NH2 nhận proton, phương trình (2) như sau: (2) R-NH2 + H+ ↔ R-NH3+ + + Theo thuyết Bronted và Lowry về acid và base, aminoacid có thể cho H (1) và nhận H (2) nên nó thể hiện tính acid và base hay nói cách khác aminoacid có tính lưỡng tính. Trong dung dịch, aminoacid thường tồn tại ở dạng ion lưỡng cực (dạng Zwitterion) hay dạng muối nội. Tương ứng với hai phân ly (1) và (2), ta có hai hằng số phân ly: K = CCOO . CH + K = 1 CNH . CH+ 2 2 CCOOH CNH+ 3 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………14 Giá trị K1 và K2 của các aminoacid khác nhau, K1 = 10-4 – 10-6 và K2 = 10-8 – 10-10. Người ta thường dùng pK1 = -log10K1, pK2 = - log10K2 cho các aminoacid. ðối với mỗi aminoacid, khi biết giá trị pK1 và pK2, người ta hoàn toàn có thể xác ñịnh tỷ lệ các phân tử bị ion hóa tại một pH nào ñó (pH = log10[H+]) bằng cách thay giá trị [H+] vào biểu thức của K1 và K2. Như vậy, mức ñộ ion hóa của aminoacid phụ thuộc vào pH của môi trường. Khi thay ñổi pH của một dung dịch aminoacid phân tử aminoacid sẽ tích ñiện (-) hoặc (+): pH thấp pH cao - Aminoacid ở dạng cation - Aminoacid ở dạng anion - Trong ñiện trường, di - Trong ñiện trường, di chuyển về cực âm. chuyển về cực dương. Khi pH môi trường thay ñổi, aminoacid chuyển dần từ cation sang anion, như vậy sẽ có một giá trị pH nào ñó tại ñấy aminoacid sẽ trung hòa về ñiện. Giá trị pH ñó ñược gọi là ñiểm ñẳng ñiện của aminoacid (isoelectric point ) và ñược ký hiệu là pHi hay pI. Giá trị ñẳng ñiện của aminoacid phụ thuộc vào số lượng nhóm amine và carboxyl có trong phân tử aminoacid. Aminoacid có nhiều nhóm amine có ñiểm ñẳng ñiện cao và ngược lại. ðối với aminoacid có một nhóm amine và một nhóm carboxyl, pH ñẳng ñiện ñược xác ñịnh bằng công thức: pI = pHi = 1/2(pK1 + pK2). ðể nghiên cứu sự phân ly của các aminiacid và xác ñịnh các giá trị pK, người ta thường dùng HCl hoặc NaOH ñể thêm vào dung dịch aminoacid, ño pH sau mỗi lần thêm và xây dựng ñường cong chuẩn ñộ. Hình 1-6. giới thiệu ñường cong chuẩn ñộ của glycine. Hình 1-6. ðường cong chuẩn ñộ của glycine. Hình 1-6. cho thấy glycine có pK1 = 2.34; pK2 = 9.6 và pI = (2.34 + 9.6)/2 = 5.97. Giá trị ñẳng ñiện của các aminoacid ñược giới thiệu ở bảng 1-1. Giá trị ñẳng ñiện ñược ứng dụng ñể tách các aminoacid trong hỗn hợp bằng phương pháp ñiện di. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………15
- Phản ứng decarboxyl hóa Phản ứng này có thể thực hiện bằng con ñường hóa học trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên trong cơ thể sống phản ứng này ñược xúc tác bởi enzyme. Phản ứng này ñược giới thiệu kỹ hơn trong chương về sự trao ñổi protein và aminoacid. d. Phản ứng của nhóm amine - Tạo muối với acid - Phản ứng với formaldehyde (phản ứng Sörensen) Formadehyde có thể phản ứng với nhóm amine của aminoacid ở nhiệt ñộ thường và pH trung tính ñể tạo dẫn xuất dihydroxymethyl. Ở dẫn xuất này, nhóm amine bị khóa, người ta có thể dùng một base ñể trung hòa gốc –COOH. Lượng kiềm tiêu tốn hết ñược dùng ñể xác ñịnh hàm lượng ñạm formol hay nitơ formol. Phản ứng này ñược dùng ñể xác ñịnh hàm lượng ñạm formol trong dung dịch. - Phản ứng với acid nitrơ (phản ứng Val Slyke) Acid nitrơ có thể phản ứng với nhóm amin của aminoacid giải phóng ra nitơ phân tử. Lượng nitơ phân tử thoát ra có thể ñịnh lượng ñược. ðây chính là nguyên tắc của phương pháp Val-Slyke ñể xác ñịnh số nhóm –NH2 tự do của aminoacid, của peptid, của protein do ñó cho phép theo dõi sự thủy phân protein. - Phản ứng desamine hóa Phản ứng loại nhóm amine và phản ứng chuyển vị nhóm amine là hai phản ứng enzyme rất quan trọng. Các phản ứng này ñược giới thiệu kỹ trong chương về sự trao ñổi protein và aminoacid. e. Phản ứng liên quan ñến sự có mặt ñồng thời của nhóm carboxyl và nhóm amine ở vị trí α Phản ứng ninhydrin: ðây là phản ứng ñặc trưng của aminoacid. Nguyên tắc của phản ứng như sau: ở nhiệt ñộ cao, ninhydrin tác dụng với aminoacid tạo phức hợp có màu tím ñỏ. Cơ chế của phản ứng ở hình 1-7. Phản ứng này ñược ứng dụng ñể hiện màu aminoacid trong phân tích ñịnh tính aminoacid bằng sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, ñiện di hoặc dùng trong phân tích ñịnh lượng aminoacid của một hỗn hợp aminoacid (phản ứng và ño cường ñộ màu của các phân ñoạn ñi ra khỏi sắc ký trao ñổi ion). f. Phản ứng tạo phức với kim loại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………16 Hình 1-7. Cơ chế của phản ứng Ninhydrin.
Nhóm thiol (-SH) của cysteine có thể bị oxi hóa tạo cystine. Hệ cysteine – cystine do ñó có thể hoạt ñộng như hệ cho và nhận ñiện tử. Ngoài ra việc oxi hóa các nhóm –SH của cysteine cho phép tạo các cầu disulfid, liên kết ñóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo và duy trì cấu trúc bậc ba của phân tử protein. - Phản ứng tạo ester - Phản ứng tạo amid Chỉ với 20 aminoacid, hàng ngàn, hàng vạn phân tử protein ñã ñược xây dựng nên ñảm bảo nhiều chức năng quan trọng của cơ thể sống. Sự ña dạng của phân tử protein do ñó ñược quyết ñịnh bởi sự sắp xếp các aminoacid trong phân tử protein. 1.3. CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN 1.3.1. Peptide và thuyết polypeptide a. Peptide Peptide là hợp chất ñược hình thành từ hai aminoacid trở lên liên kết với nhau bằng liên kết peptide. Liên kết peptide ñược hình thành do sự ngưng tụ giữa nhóm carboxyl của aminoacid này và nhóm amine của aminoacid khác, có loại ñi một phân tử nước. H2 O H 2N CH R1 C O OH + H N CH C H R2 O OH H 2N CH C N CH R1 O H R2 COOH Liên kết peptide là liên kết bền vững, nó chỉ bị bẽ gãy dưới tác dụng của peptidase hoặc trong dung dịch acid ñặc, ở nhiệt ñộ cao, trong thời gian dài (ví dụ HCl 6N, 110°C, 24 giờ). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………18 Tùy thuộc vào số lượng aminoacid tham gia cấu tạo peptide mà chúng ñược gọi là dipeptide (2 aminoacid), tripeptide (3 aminoacid), tetrepeptide (4 aminoacid), oligopeptide (5-10 aminoacid), polypeptide (>10 aminoacid). Mỗi peptide ñều có một ñầu có chứa nhóm amin tự do, ñược gọi là ñầu N, ñầu còn lại chứa nhóm carboxyl tự do ñược gọi là ñầu C. Trong chuỗi peptide, aminoacid ñược ñánh số thứ tự bắt ñầu từ ñầu N. ðể gọi tên peptide, người ta gọi tên lần lượt các aminacid bắt ñầu từ ñầu N trong ñó các aminacid nào có nhóm carboxyl tham gia tạo liên kết peptide có ñuôi ñược ñổi thành „yl“. Tên aminoacid ñầu C ñược giữ nguyên. Ví dụ peptide alanyl-valyl-phenylalanyl-isoleucine, ñược viết tắt là Ala-Val-Phe-Ile. Peptide có các tính chất vật lý và hóa học không khác nhiều so với aminoacid do chúng cũng có một nhóm amine và một nhóm carboxyl tự do. Sự khác biệt nếu có do mạch bên R tạo nên. Một số peptide có vai trò sinh học quan trọng ñược giới thiệu sau ñây: - Glutathione: Glutathione là một tripeptide (γ-L-glutamyl-L-cysteyl-glycine) có thể tồn tại ở dạng khử (dạng thiol) hoặc dạng oxi hóa (hai phân tử gắn với nhau qua cầu disulfide). ðiều này cho phép glutathione vận chuyển ñiện tử trong các phản ứng oxi hóa khử. - Các peptide hormon: một số peptide, ñặc biệt là các hormon tiết ra bởi tuyến yên và tuyến tụy ñều là các peptide. Ocytocine có tác dụng tăng cường co cơ dạ con, vasopressin làm tăng áp suất máu và có tác dụng chống lợi tiểu. Insuline là hormon ñược tiết ra bởi tuyến tụy làm nhiệm vụ ñiều hòa lượng ñường glucose trong máu. Khi hàm lượng glucose trong máu vượt quá 6x10-3M, insuline ñược tiết ra từ tuyến yên và làm giảm nồng ñộ ñường xuống mức nền 5x10-3M. Insuline ñược cấu tạo từ hai chuỗi polypeptide: chuỗi A chứa 21 aminoacid, chuỗi B chứa 30 aminoacid. Hai chuỗi này gắn với nhau nhờ hai cầu disulfide (Hình 1-7.) Hình 1-8. Cấu tạo của insuline - Các peptide có hoạt tính kháng sinh. Một số kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật có bản chất peptide như tyrocidine (Hình 1-4.). b. Thuyết polypeptide về cấu tạo phân tử protein Vào năm 1888, A. J. Danhilepski (Nga) ñã phát hiện ra liên kết –CO-NH- ñóng vai trò quan trọng trong cấu tạo của protein. Năm 1900, Emil Fisher tiếp tục ñi sâu nghiên cứu cấu tạo phân tử protein, ñã khẳng ñịnh sự tồn tại của liên kết –CO-NH- , gọi nó là liên kết peptide và ñề ra học thuyết polypeptide về cấu tạo phân tử protein. Học thuyết ñược phát biểu như sau: “Phân tử protein là một hoặc những chuỗi polypeptide khổng lồ, ñược xây dựng từ hàng chục ñến hàng trăm gốc aminoacid liên kết với nhau bằng liên kết peptide“. Nhiều kết quả thí nghiệm ñã khẳng ñịnh tính ñúng ñắn của học thuyết polypeptide về cấu tạo phân tử protein: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………19 - Phân tử protein ở trạng thái nguyên thể có rất ít nhóm amine và nhóm carboxyl tự do. - Khi thủy phân protein có sự giải phóng một cách từ từ các nhóm amine và nhóm carboxyl với tỷ lệ hết sức nghiêm ngặt 1/1. ðiều này nói lên sự phân giải liên kết peptide. - Phản ứng Biure là phản ứng ñặc trưng cho liên kết peptide. Tất cả protein ñều tham gia phản ứng Biure, ñiều này cho thấy trong phân tử protein có chứa các liên kết peptide. - Bản chất polypeptide của phân tử protein ñơn giản nhất là insulin ñã ñược chứng minh khi nó ñược tổng hợp bằng con ñường hóa học trong phòng thí nghiệm từ các aminoacid. Ribonuclease cũng ñược tổng hợp trong phòng thí nghiệm từ 124 aminoacid. - Bằng phương pháp ñồ thị tia Rơnghen, người ta thấy rằng chuỗi polypeptide của phân tử protein là sự sắp xếp một cách liên tục các aminoacid ñặc trưng cho từng phân tử protein. Các tính chất của liên kết peptide cũng ñã ñược xác ñịnh (Hình 1-9.). Hình 1-9. ðặc ñiểm liên kết peptide Bốn nguyên tử C, O, H, N tham gia tạo liên kết peptide nằm trong cũng mặt phẳng. Nguyên tử O và H luôn nằm ở vị trí trans so với liên kết peptide. Các nhóm liên kết với Cα có khả năng quay tự do. Liên kết giữa nguyên tử C và N trong nhóm –CO-NH- về ñặc tính có thể xem như dạng trung gian của liên kết ñôi và liên kết ñơn do hiệu ứng liên hợp của eΠ và cặp ñiện tử không chia của nguyên tử oxi. ðiều này cho phép aminoacid dễ dàng chuyển từ dạng ceto sang dạng enol. Dạng enol là dạng không bền do nguyên tử hydro rất linh ñộng do ñó aminoacid có khả năng phản ứng cao, ñảm bảo tính ña chức năng của phân tử protein. Theo mức ñộ phức tạp của phân tử, bốn mức cấu trúc của protein ñược ñưa ra. 1.3.2. Cấu trúc bậc một của protein a. ðịnh nghĩa Cấu trúc bậc một của protein là thành phần và trình tự sắp xếp các gốc aminoacid trong mạch polypeptide. Nếu thay ñổi dù chỉ một aminoacid bất kỳ của phân tử protein, cấu trúc bậc một bị thay ñổi, các tính chất cũng như chức năng của phân tử protein cũng bị thay ñổi theo. b. Liên kết tạo và giữ vững Liên kết tạo và giữ vững cấu trúc bậc 1 là liên kết peptide. ðây là loại liên kết rất bền do ñó cấu trúc bậc một là cấu trúc bền nhất trong bốn mức cấu trúc của phân tử protein. c. Vai trò Cấu trúc bậc một quyết ñịnh chức năng sinh học của phân tử protein. Người ta thấy rằng các protein có chức năng sinh học giống nhau thì có cấu trúc bậc một tương tự nhau. Ubiquitine, một protein tham gia Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………20 ñiều hòa sự phân hủy các protein khác có thứ tự sắp xếp các aminoacid tương ñồng nhau ở các loài rất khác nhau về mặt tiến hóa như người và ruồi dấm. Cytochrome c, làm nhiệm vụ vận chuyển ñiện tử trong quá trình hô hấp ở ty thể là một polypeptide dài 100 aminoacid. Người ta ñã nghiên cứu cytochrome c ở 60 loài khác nhau và thấy rằng có ñến 27 vị trí aminoacid giống nhau, ở một số vị trí khác có sự thay thế các gốc aminoacid có tính chất giống nhau: arginine ñược thay bằng lysine (cùng mang ñiện tích dương). Sự thay ñổi dù chỉ một aminoacid trong chuỗi polypeptid tức là thay ñổi cấu trúc bậc một của protein sẽ làm thay ñổi tính chất và chức năng sinh học của protein. Theo kết quả nghiên cứu, 1/3 trong số 1400 bệnh di truyền liên quan ñến protein bất hoạt có nguồn gốc là sự thay ñổi trình tự aminoacid trong cấu trúc bậc 1. Ví dụ ñiển hình là bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm ở người: do acid glutamic ở vị trí số 6 trong chuỗi β của hồng cầu ñổi chỗ cho aminoacid valin ở vị trí thứ 7 làm cho hồng cầu chuyển từ dạng hình cầu sang dạng hình lưỡi liềm và không còn khả năng vận chuyển oxi cho cơ thể (Hình 1-10). Hình 1-10. Bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm Cấu trúc bậc một là bản dịch mã di truyền. Cấu trúc bậc một cho biết quan hệ họ hàng và lịch sử tiến hóa của thế giới sống. 1.3.3. Cấu trúc bậc hai của protein a. ðịnh nghĩa Sự sắp xếp thích hợp trong không gian của chuỗi polypeptide tạo nên cấu trúc bậc hai. Do các nguyên tử Cα có thể quay tự do xung quanh trục tạo thành bởi các liên kết ñồng hóa trị làm cho chuỗi polypeptid có rất nhiều hình thể. Tuy nhiên, trong những ñiều kiện bình thường, ñặc biệt là pH và nhiệt ñộ thì mỗi chuỗi polypeptide chỉ có một hình thể ñặc trưng gọi là hình thể tự nhiên. Về phương diện nhiệt ñộng học, hình thể này có năng lượng tự do nhỏ nhất do ñó nó là hệ thống bền. Sự sắp xếp chuỗi polypeptide một cách hợp lý là sự sắp xếp sao cho chuỗi polypeptide có hình thể có lợi nhất về mặt năng lượng tức là nó có năng lượng tự do nhỏ nhất do ñó nó bền nhất. Trong các protein, người ta phát hiện ra hai cấu trúc bậc hai chủ yếu sau ñây: cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β. b. Cấu trúc xoắn α ( α Helix) Cấu trúc xoắn α là cấu trúc có trật tự. Trong cấu trúc xoắn α, bộ khung polypeptide xoắn quanh một trục. Mỗi vòng xoắn có 3.6 aminoacid (18 aminoacid tạo nên 5 vòng xoắn). Các nguyên tử Cα nằm trên ñường sinh của hình trụ bao quanh xoắn ốc. Các mạch bên R hướng ra phía ngoài. ðường kính của xoắn ốc (không kể mạch bên R) là 0.6 nm. Bước xoắn là 0.54 nm. Góc xoắn 26°. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………21 Liên kết tạo và giữ vững cấu trúc xoắn α là liên kết hydro. Các liên kết hydro gần như song song với trục của xoắn, nối nhóm –NH của liên kết peptide này với nhóm –CO của liên kết peptide thứ ba kề với nó (Hình1-11). Như vậy mỗi nhóm –CO-NH- có thể tạo hai liên kết hydro với các nhóm –CO-NHphía trước và phía sau nó. Số lượng liên kết hydro do ñó rất lớn. Thêm vào ñó, cấu trúc xoắn α có mật ñộ dày ñặc, làm giảm tương tác với các phân tử khác. Chính vì các lý do trên, cấu trúc xoắn α bền, tương tự cái lò xo. Hình 1-11. Liên kết hydro trong cấu trúc xoắn α Khi tạo cấu trúc xoắn α, khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang phải tăng. ðiều này ứng dụng ñể xác ñịnh tỷ lệ xoắn trong phân tử protein. Khả năng tham gia tạo xoắn α của các aminoacid là khác nhau. Ala, Leu, Phe, Tyr, Cys, Met, His, Asn, Glu, Val có khả năng tạo xoắn α bền trong khi Ser, Ile, Arg, Thr, Gly cũng tạo ñược xoắn α nhưng không bền. Nếu có proline xen giữa các bước của xoắn sẽ làm mất ñi ñộ ñồng ñều của xoắn và làm xoắn có hình thể khác ñi. Chính do vậy, nếu biết cấu trúc bậc một của phân tử protein nào ñó có thể dự ñoán ñược tỷ lệ xoắn cũng như vị trí xoắn α trong phân tử protein ñó. Xoắn α là cấu trúc quan trọng và phổ biến nhất của các protein hình cầu như hemoglobine, myoglobine (75% xoắn α), albumine huyết tương (50% xoắn α). c. Cấu trúc gấp nếp β Khi các ñoạn mạch của cùng một chuỗi polypeptide hoặc hai chuỗi polypeptide tiến lại gần nhau sẽ có sự tạo thành liên kết hydro giữa các nhóm –CO-NH- ñảm bảo cho sự hình thành cấu trúc gấp nếp β. Trong cấu trúc gấp nếp β, bộ khung sợi polypeptide ñược xếp theo dạng zigzag. Các nguyên tử của liên kết peptide nằm trong cùng một mặt phẳng, nguyên tử Cα nằm trên giao tuyến của hai mặt phẳng chứa hai liên kết peptide kề nhau, các gốc R hướng vuông góc với mặt phẳng lớp nếp gấp. Các ñường zigzag nằm song song với nhau tạo cấu trúc dạng tấm. Các ñường zigzag có thể song song hoặc ñối song. Cấu trúc nếp gấp β ñược giữ chặt bởi các liên kết hydro giữa các nhóm –CO-NH- (Hình 1-12). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………22 Hình 1-12. Cấu trúc nếp gấp β
Hình 1-13. Cấu tạo của collagen Collagen ñược cấu tạo từ nhiều sợi lớn, mỗi sợi lớn ñến lượt nó lại ñược cấu tạo từ nhiều sợi nhỏ. Mỗi sợi nhỏ bao gồm nhiều sợi xoắn tropocollagen. Mỗi tropocollagen bao gồm ba sợi polypeptide có cấu tạo xoắn α xoắn lại với nhau (Hình 1-13). Collagen có trong mô liên kết, khớp nối, dịch hữu cơ tủy xương. α-keratine cũng ñược cấu tạo từ nhiều chuỗi polypeptide cấu tạo xoắn α, xoắn lại với nhau. α-keratine là thành phần chủ yếu của tóc, lông, móng tay, vuốt của ñộng vật có xương sống ñảm bảo ñộ dai chắc cho các bộ phận này. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………23 Ngoài hai kiểu cấu trúc bậc hai kể trên, trong phân tử protein còn có các dạng cấu trúc mặt cong β, cấu trúc hình thể cuộn thống kê hay cấu trúc xoắn ngẫu nhiên. 1.3.4. Cấu trúc bậc ba của protein a. ðịnh nghĩa Chuỗi peptide với các vùng có cấu trúc bậc hai xác ñịnh (xoắn α, gấp nếp β, cong β) hoặc kém xác ñịnh (xoắn ngẫu nhiên) sắp xếp lại trong không gian ba chiều tạo thành cấu trúc bậc ba. b. Liên kết tạo và giữ vững Nhiều loại liên kết tham gia tạo và giữ vững cấu trúc bậc ba: liên kết disulfid, liên kết hydro, tương tác kỵ nước, liên kết ion (Hình 1-14). Hình 1-14. Các liên kết tham gia tạo và giữ vững cấu trúc bậc ba Liên kết disulfide ñược tạo thành giữa các gốc cysteine. ðây là liên kết ñồng hóa trị, bền. Liên kết này ñóng vai trò quan trọng nhất trong việc duy trì cấu trúc bậc ba của chuỗi polypeptide và làm cho phân tử protein ở trạng thái ổn ñịnh. Liên kết ion là liên kết tĩnh ñiện, tạo thành giữa hai phần mang ñiện tích trái dấu (ví dụ giữa nhóm – COO- và –NH3+). Liên kết này yếu hơn so với liên kết disulfide. Liên kết hydro ñược tạo thành giữa nguyên tử hydro có gắn với nguyên tử nitơ hoặc oxi (mật ñộ ñiện tử tại hydro nhỏ) và nguyên tử nitơ hoặc oxi có ñôi ñiện tử không chia (mật ñộ ñiện tử lớn). Tương tác kỵ nước ñược tạo thành giữa các mạch bên kỵ nước của các aminoacid như Val, Leu, Ile, Phe. Các chuỗi mạch hydrocarbon kỵ nước có xu hướng tiến lại gần nhau và tương tác với nhau nhờ lực Van der Waals. Mặc dù ngoài cầu disulfide, các liên kết còn lại là các liên kết yếu nhưng do số lượng của chúng trong phân tử protein lớn nên chúng vẫn có khả năng giữ vững cấu trúc bậc ba của phân tử protein.. Ngoài sự tương tác giữa các aminoacid trên cùng một chuỗi polypeptide, sự tương tác của các aminoacid của protein với các phân tử dung môi xung quanh cũng làm cho phân tử protein có cấu trúc xác ñịnh. Các protein hình cầu tan trong nước như myoglobine, hemoglobine có các gốc aminoacid ưa nước phân bố ñều ñặn trên bề mặt, các gốc aminoacid kỵ nước quay vào phía trong. Các protein không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ lại có các aminoacid kỵ nước phân bố phía ngoài. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………24 ðể mô tả cấu trúc bậc ba của protein, người ta thường dùng cấu trúc không gian lấp ñầy hoặc mô hình dải băng trong ñó mô hình dải băng thường ñược sử dụng. Trong mô hình này, cấu trúc xoắn α ñược mô tả bằng hình xoắn, cấu trúc gấp nếp β ñược mô tả bằng mũi tên. Hình 1-15. mô tả cấu trúc bậc ba của myoglobine, protein ñược cấu tạo từ 153 aminoacid, bao gồm 8 ñoạn xoắn α xen bởi 7 ñoạn có cấu trúc uốn β, không chứa gấp nếp β. Hình 1-15. Cấu trúc bậc ba của myoglobine.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………25 Liên kết tạo và giữ vững cấu trúc bậc bốn là liên kết hydro, liên kết ion, tương tác kỵ nước. ðây là các liên kết phi ñồng hóa trị, là các liên kết yếu do ñó cấu trúc bậc 4 dễ bị phá hủy. c. Vai trò Protein có cấu trúc bậc bốn ñảm bảo các chức năng vận chuyển (hemoglobine), xúc tác (các enzyme), ñiều hòa.... Ví dụ ñiển hình về protein có cấu trúc bậc 4 là hemoglobine làm nhiệm vụ vận chuyển oxi trong máu người và ñộng vật có xương sống. Phân tử hemoglobine ñược hình thành từ 4 chuỗi polypeptide: hai chuỗi α, mỗi chuỗi gồm 141 aminoacid và hai chuỗi β, mỗi chuỗi gồm 146 aminoacid. Mỗi chuỗi polypeptide liên kết với một nhóm hem có nguyên tử sắt ở giữa (Hình 1-16). Trong không gian, 4 nhóm hem ñược sắp xếp tại bốn ñỉnh của một hình tứ diện ñều làm cho phân tử hemoglobine có dạng hình cầu. Mỗi nhóm hem là một trung tâm dể kết hợp với oxi do ñó mỗi phân tử hemoglobine có thể kết hợp với bốn phân tử oxi. Hb + 4O2 → Hb(O2)4 Khi kết hợp với oxi, cấu trúc hemoglobine thay ñổi, các phần dưới ñơn vị dịch lại gần nhau hơn, thể tích phân tử do ñó giảm. Khi tách oxi tại các cơ quan của cơ thể, thể tích phân tử hemoglobine trở lại bình thường. Hình 1-16. Cấu trúc bậc bốn của hemoglobine và câu tạo nhóm hem 1.4. TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN 1.4.1. Hình dạng và kích thước Protein có khối lượng phân tử lớn từ hàng chục ñến hàng trăm nghìn Dalton. Khối lượng của một số protein ñược giới thiệu ở bảng 1-2. ðể xác ñịnh khối lượng phân tử protein, Sverbergs, 1923 ñã ñề nghị sử dụng phương pháp siêu ly tâm. Dựa vào tốc ñộ kết lắng của các phân tử protein dưới tác dụng của lực trọng trường có thể tính ñược khối lượng phân tử của chúng. Về mặt hình dạng, protein ñược hai thành hai loại: protein hình sợi và protein hình cầu. Protein dạng sợi: trong loại protein này, các chuỗi polypeptid phân bố song song theo một trục tạo thành các sợi dài hoặc các lớp. Protein dạng sợi là phần tử cấu trúc cơ bản của ñộng vật bậc cao như collagen của gân và mô xương, α-keratine của lông, tóc, sừng, móng vuốt. Các protein dạng sợi tương ñối trơ về mặt hóa học, chủ yếu có chức năng cơ học. Protein hình cầu: trong loại protein này, các chuỗi polypeptid cuốn lại với nhau thành cấu trúc hình cầu. Hầu hết các protein hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng. Những protein này ñảm bảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………26 chức năng hoạt ñộng cho tế bào. Hầu hết các enzyme, các tế bào, một số các hormon, albumine huyết thanh, hemoglobine ñều là protein hình cầu. Bảng 1-2. Khối lượng phân tử của một số protein ñiển hình (Ngô Xuân Mạnh, 2006) Protein Khối lượng phân tử (Da) 5.733 13.000 13.700 13.930 16.890 21.600 22.000 64.500 102.000 145.000 450.000 513.000 1.000.000 Insulin (bò) Cytochrome c (người) Ribonuclease A (bò) Lysosyme (trứng) Myoglobine (tim) Chymotrypsine (bò) Chymotripsinogen (bò) Hemoglobine (người) Hexokinase (nấm men) Immunoglobuline G (người) Polymerase (E.coli) Apolypoprotein (người) Glutamate dehydrogenase (bò) Số gốc aminoacid 51 104 124 129 153 241 245 574 800 1.320 4.100 4.350 8.300 Số chuỗi polypeptiñe 2 1 1 1 1 3 1 4 2 4 5 1 40 1.4.2. Tính chất lưỡng tính Protein có tính chất lưỡng tính do nó chứa các nhóm phân cực (amin và carboxyl) ở mạch bên R của các aminoacid. Tùy thuộc vào số lượng aminoacid kiềm tính, acid tính và pH của môi trường mà protein tích ñiện âm hay dương và khi ñạt nó trong ñiện trường nó sẽ dịch chuyển về cực dương hay cực âm. - H+ + H+ pH thấp Protein tích ñiện dương Có khả năng nhận proton nên là một base Trong ñiện trường di chuyển về cực âm - H+ + H+ pH cao Protein tích ñiện âm Có khả năng cho proton nên là một acid Trong ñiện trường di chuyển về cực dương Như vậy khi ñặt protein trong ñiện trường, tùy thuộc vào pH của môi trường mà protein sẽ dịch chuyển về cực âm hay cực dương. Có một giá trị pH tại ñó protein không dịch chuyển trong ñiện trường, tổng ñiện tích dương bằng tổng ñiện tích âm hay phân tử protein lúc ñó trung hòa về ñiện. Giá trị pH ñó ñược gọi là ñiểm ñẳng ñiện của protein và ñược ký hiệu là pI. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………27 Các protein khác nhau thì có ñiểm ñằng ñiện khác nhau. Giá trị ñẳng ñiện của protein phụ thuộc vào số lượng aminoacid kiềm tính và acid tính cấu tạo nên chúng. Protein có nhiều aminoacid acid tính có pI tại vùng acid và ngược lại. Pepsin có pI = 1 và Trypsin có pI = 10.5. Ở môi trường có pH = pI, protein dễ dàng kết tụ lại với nhau do ñó có thể sử dụng tính chất này ñể xác ñịnh pI của protein cũng như ñể kết tủa protein. Thêm vào ñó, do sự sai khác về pI giữa các protein khác nhau nên có thể ñiều chỉnh pH của môi trường ñể tách protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. 1.4.3. Tính chất bị biến tính a. Khái niệm về biến tính Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý (nhiệt ñộ, tia UV, sóng siêu âm, khuấy cơ học...) hoặc các tác nhân hóa học (acid mạnh, kiềm mạnh, muối của kim loại nặng, tanin...), protein bị biến ñổi các cấu trúc bậc hai, ba, bốn và mất ñi các tính chất ban ñầu. Hiện tượng này ñược gọi là sự biến tính protein. Thịt, trứng sau khi gia nhiệt thì bị ñặc lại hay lòng trắng trứng khi bị khuấy thì tạo thành kem là các ví dụ về sự biến tính protein. Có hai loại biến tính là biến tính thuận nghịch và biến tính không thuận nghịch. Biến tính thuận nghịch là loại biến tính mà sau khi loại ñi yếu tố gây biến tính, protein quay trở lại trạng thái ban ñầu, các tính chất ban ñầu của nó ñược khôi phục. Biến tính thuận nghịch chỉ xảy ra nếu sử dụng các tác nhân biến tính nhẹ nhàng như acid, kiềm ở nồng ñộ thấp hoặc nhiệt ñộ thấp (bảo quản nông sản ở nhiệt ñộ thấp). Biến tính không thuận nghịch là biến tính mà sau khi loại ñi yếu tố gây biến tính, protein không quay trở lại ñược trạng thái ban ñầu, các tính chất ban ñầu của nó không ñược khôi phục. Albumin làng trắng trứng bị ñông tụ khi ñun nóng ở nhiệt ñộ 100°C; albumin, globulin của hạt ñậu tương bị kết tủa dưới tác dụng của pH, nhiệt ñộ nhất ñịnh khi làm ñậu phụ là các ví dụ về biến tính không thuận nghịch. Tính chất của protein khi bị biến tính: - ñộ hòa tan của protein giảm do bị lộ các nhóm kỵ nước - mất hoạt tính sinh học - tăng ñộ nhạy ñối với sự tấn công của các enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với các vùng tấn công ñặc hiệu của enzyme. - tăng ñộ nhớt nội tại - mất khả năng kết tinh. b. Các yếu tố gây biến tính - Nhiệt ñộ: Nhiệt ñộ là tác nhân gây biến tính thường gặp nhất. Dưới tác dụng của nhiệt ñộ cao, các liên kết bị ñứt ra, phân tử protein bị giãn mạch, mất ñi cấu trúc và chức năng ban ñầu ñặc biệt là chức năng sinh học. Các protein-enzyme thường bị biến tính và mất ñi khả năng xúc tác ở nhiệt ñộ cao hơn 70°C. Nhiệt ñộ thấp cũng làm biến tính protein: Nhiều enzyme bền ở nhiệt ñộ thường nhưng bị vô hoạt khi ở nhiệt ñộ 0°C. Protein của trứng, sữa thường bị tập hợp và kết tủa ở nhiệt ñộ lạnh ñông. Các protein ở trạng thái khô thường bền với biến tính nhiệt. Các protein có tỷ lệ aminoacid kỵ nước/aminoacid ưa nước cao thì dễ bị biến tính ở nhiệt ñộ thấp. - pH quá cao và quá thấp Phần lớn protein bị biến tính tại các pH quá cao hoặc quá thấp. Các pH cực trị này tạo ra lực ñẩy tĩnh ñiện giữa các nhóm bị ion hóa do ñó làm giãn mạch phân tử protein. - Các ion kim loại Các ion kim loại nặng (Cu++, Fe++, Hg++, Ag+) phản ứng nhanh với protein tạo phức trong ñó có những ion tạo phức bền với nhóm thiol. - Các dung môi hữu cơ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………28 Phần lớn các dung môi hữu cơ là các tác nhân biến tính protein. Các dung môi hữu cơ làm thay ñổi hằng số ñiện môi của môi trường do ñó làm biến ñổi các lực tĩnh ñiện vốn làm bền phân tử protein. Các dung môi hữu cơ không cực cũng có thể xâm nhập vào các vùng kỵ nước, phá vỡ các tương tác kỵ nước do ñó làm biến tính protein. - Xử lý cơ học Các xử lý cơ học như nhào trộn hoặc cán bột mỳ tạo ra các lực cắt làm biến tính protein. ðộng tác kéo ñi kéo lại nhiều lần cũng làm biến tính protein do phá hủy các xoắn α. - Các tia bức xạ Các tia cực tím bị hấp thụ bởi các gốc aminoacid thơm do ñó có thể dẫn ñến làm biến ñổi hình thể và nếu mức năng lượng ñủ lớn có thể làm ñứt cầu disulfide. Các bức xạ của tia γ và các tia ion hóa cũng làm biến ñổi hình thể, oxi hóa một số gốc aminoacid, phá hủy cầu ñồng hóa trị, ion hóa và tạo thành các gốc protein tự do, cũng như tái tổ hợp và trùng hợp protein. Các yếu tố làm biến tình protein thường ñược sử dụng ñể loại bỏ protein ra khỏi dung dịch, làm ngừng phản ứng enzyme. Các phương pháp có thể dùng là ñun sôi dung dịch protein; dùng các hóa chất làm biến tính như các acid trichloroacetic, acid volframic, acid picric, acid sulfosalicilic; dùng muối của các kim loại nặng Pb, Hg, Cu, Fe. 1.4.4. Các phản ứng ñặc trưng a. Phản ứng Biure Là phản ứng ñặc trưng cho liên kết peptide. Tất cả các peptide có từ hai liên kết peptide trở lên ñều cho phản ứng này. Cơ chế của phản ứng: trong môi trường kiềm mạnh, các liên kết peptide trong phân tử protein phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím xanh (Hình 1-17). Phức chất màu hấp thụ cực ñại tại bước sóng 540nm. Cường ñộ của phức phụ thuộc vào nồng ñộ protein và nồng ñộ Cu++. Phản ứng này ñược ứng dụng rộng rãi ñể phát hiện và ñịnh lượng protein. b. Phản ứng Xanthoprotein Phản ứng này ñặc trưng cho các aminoacid mang vòng thơm. Cơ chế phản ứng: dưới tác dụng của HNO3 ñậm ñặc các aminoacid mang vòng thơm của protein bị nitro hóa tạo dẫn xuất dinitro có màu vàng. Khi hỗ biến các dinitro tạo thành dạng enol và trong môi trường kiềm sẽ tạo muối dạng quinoid có màu da cam (Hình 1-18). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………29 Hình 1-17. Cơ chế phản ứng Biure Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………30 Hình 1-18. Cơ chế phản ứng Xanthoprotein 1.5. PHÂN LOẠI PROTEIN Do sự ña dạng về cấu trúc và chức năng của protein nên việc phân loại protein gặp khó khăn. Người ta phải dựa vào hình dạng (hình cầu hay sợi), chức năng sinh học (xúc tác, vận chuyển, bảo vệ...), ñộ hòa tan hay cấu tạo ñể phân loại protein. 1.5.1. Phân loại dựa vào ñộ hòa tan Dựa vào ñộ hòa tan, người ta chia các protein ñơn giản thành các nhóm sau. a. Albumin Albumin tan trong nước, bị kết tủa ở nồng ñộ (NH4)2SO4 70-100% ñộ bão hòa. ðiểm ñẳng ñiện của chúng thường lớn hơn 7. Albumin phổ biến trong tế bào ñộng vật và thực vật. Albumin của lòng trắng trứng gà, của huyết thanh là ví dụ của protein nhóm này. b. Globulin Globulin không tan trong nước, tan trong dung dịch muối loãng, kết tủa ở nồng ñộ (NH4)2SO4 50% ñộ bão hòa. Ở thực vật, globulin có trong lá, ñặc biệt trong hạt của các cây họ ñậu. Globulin là protein dự trữ chủ yếu của các cây họ ñậu, chiếm khoảng 60-80% protein tổng số của các hạt này. Ở nhiều hạt hòa thảo, globulin chỉ chiếm khoảng 2-13% protein của hạt và tập trung chủ yếu ở aloron của hạt. Các protein thuộc nhóm này thường chứa saccharide. c. Prolamin Prolamin không tan trong nước và dung dịch muối, tan trong ethanol hoặc isopropanol 70-80%. Ở một số hạt hòa thảo, lượng protein hòa tan trong cồn có thể ñạt ñến 30-60% protein tổng số. Gliadin của lúa mỳ, hordein của ñại mạch và zein của ngô là những protein thuộc loại này. d. Glutelin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………31 Glutelin chỉ tan trong dung dịch kiềm và dung dịch acid loãng, có trong nội nhũ của hạt hòa thảo và một số hạt của cây khác. Ví dụ về protein loại này là glutelin của lúa mỳ, orizenin của lúa. Prolamin và glutelin là các protein dự trữ ñiển hình của hạt hòa thảo, chúng kết hợp với các thành phần khác trong nội nhũ của hạt tạo thành hợp phức có khối lượng phân tử rất lớn gọi là gluten. e. Histon Là protein kiềm tính, có chứa nhiều aminoacid kiềm tính như Lys, Arg, dễ tan trong nước. Vì có tính kiềm nên các hợp chất này có thể kết hợp với các chất có tính acid như acid nucleic. 1.5.2. Phân loại dựa vào cấu tạo Dựa vào cấu tạo, protein ñược phân thành hai nhóm lớn là protein ñơn giản và protein phức tạp. Protein ñơn giản khi bị thủy phân cho các aminoacid. Protein phức tạp ñược cấu tạo từ hai phần: phần protein và phần phi protein. Phần phi protein ñược gọi là nhóm prosthetic hay nhóm ngoại. Tùy thuộc vào bản chất nhóm prosthetic mà protein ñược phân thành chromoprotein, metalloprotein, phosphoprotein, glycoprotein, lipoprotein, nucleoprotein. a. Phosphoprotein ðó là các protein có chứa acid phosphoric tạo liên kết ester với nhóm –OH của Ser hoặc Thr. Phosphoprotein phổ biến trong cơ thể sinh vật, tham gia ñiều hòa nhiều quá trình quan trọng. Ví dụ ñiển hình của protein loại này là casein của sữa, vitelline, vitellenine và phosvitine của lòng ñỏ trứng. Casein là tập hợp các protein của sữa, bị ñông tụ bởi nhiệt, muối và enzyme (chymosin và các proteinase acid khác). Khi ñiện di thu ñược các dạng casein khác nhau là α, β và γ. Các dạng này có thành phần aminoacid và hàm lượng phospho khác nhau. Hàm lượng phospho trong α, β và γ-casein lần lượt là 0.96, 0.52 và 0.1%. b. Glycoprotein Nhóm ngoại là glucid. Các glucid trong glycoprotein có thể là monosaccharide, oligosaccharide hoặc dẫn xuất của chúng. Phần glucid thường kết hợp với nhóm –OH của Ser, Thr và thường qua gốc Nacetylglucosamine hoặc N-acetylgalactosamine. Hàm lượng glucid thay ñổi trong khoảng rộng, có thể ñạt ñến 80% khối lượng phân tử glycoprotein. Glycoprotein có trong tất cả các mô ñộng vật, thực vật và vi sinh vật: các globulin miễn dịch, muxin trong nước bọt và màng nhầy, bromelain, các glycoprotein cấu trúc màng. ðối với các glycoprotein, nhóm glucid có vai trò ñịnh hướng glycoprotein trong màng và có thể có vai trò nhận biết giữa các tế bào. c. Lipoprotein Nhóm ngoại là lipid. Có hai loại lipoprotein với vai trò khác nhau là lipoprotein tế bào làm nhiệm vụ cấu tạo và lipoprotein vận chuyển làm nhiệm vụ vận chuyển lipid. Lipoprotein cấu tạo tham gia cấu tạo màng ty thể, lạp thể. Ví dụ về loại protein này có thể kể ñến lipoprotein ty thể của gan, lipovitelline, lipovitellenine của lòng ñỏ trứng. Lipid không tan trong nước nhưng khi kết hợp với protein, phần kỵ nước lipid cuộn vào trong, phần protein tạo thành lớp vỏ bọc xung quanh do ñó lipid có thể ñược vận chuyển trong môi trường nước (ví dụ trong máu). ðây là vai trò của các lipoprotein vận chuyển. Trong huyết tương có một số loại lipoprotein vận chuyển có tỷ trọng khác nhau làm nhiệm vụ vận chuyển lipid: - d < 0.94 vận chuyển triacylglycerol, cholesterol, lipid của thức ăn từ ruột non ñến mỡ, gan - d = 0.94 – 1.006 vận chuyển triacylglycerol trong cơ thể ñến mô mỡ - d = 1.006 – 1.063 vận chuyển cholesterol ñến mô mỡ - d = 1.663 – 2.210 vận chuyển cholesterol từ mô ngoại ñến gan d. Nucleoprotein Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………32 Nhóm ngoại là acid nucleic, phần protein thường có tính kiềm do ñó hai phần này liên kết với nhau rất chặt chẽ. Nucleoprotein thường tập trung trong nhân tế bào hoặc trong ribosom. Ví dụ về protein loại này là nucleosom. Nucleosom bao gồm một ñoạn DNA khoảng 160-240 cặp base nitơ cuốn quanh lõi gồm bốn cặp phân tử histon. Các nucleosom gắn với nhau nhờ DNA kết tạo thành nhiễm sắc chất. e. Chromoprotein Nhóm ngoại là hợp chất có màu. Tùy theo ñặc tính nhóm ngoại mà các chromoprotein có màu khác nhau. Hem (Hình 1-16) có màu ñỏ là nhóm ngoại của hemoglobine, myoglobine, cytochrome c, catalase; riboflavine có màu vàng là nhóm ngoại của flavoprotein (dehydrogenase hiếu khí...). Các chromoprotein có hoạt tính sinh học cao, tham gia nhiều quá trình sống quan trọng như hô hấp, oxi hóa khử. f. Metalloprotein Nhóm ngoại là kim loại. Các kim loại thường gặp là Fe, Cu, Zn, Mn, Mo... Các metalloprotein ñảm bảo nhiều chức năng sinh học khác nhau như vận chuyển và dự trữ kim loại (transferin và ferritin vận chuyển và dự trữ sắt) hay trực tiếp tham gia vào các hoạt ñộng xúc tác của enzyme: tyrosinase chứa Cu, carboxypeptidase chứa Zn, hệ nitrogenase chứa Fe, Mo. Khi kim loại bị tách khỏi phần protein, các enzyme mất hoạt tính xúc tác. Câu hỏi ôn tập: 1. Aminoacid là gì? Các aminoacid tham gia cấu tạo protein: công thức cấu tạo, tính chất và phân loại. 2. Các chức năng sinh học của phân tử protein. 3. Các mức cấu trúc của phân tử protein. 4. Các ñặc ñiểm của protein. 5. pH ñẳng ñiện của aminoacid và protein: ñịnh nghĩa, ứng dụng. 6. Phân loại protein. 7. Sự biến tính protein: ñịnh nghĩa, các tác nhân gây biến tính, ứng dụng. Tài liệu tham khảo: 1. Jaques-Henry Weil (1994). Biochimie générale. 8e Edition réservée eu augmenté. Masson Paris Milan Barcelone. 2. Lê Ngọc Tú, ðặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi ðức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên (1997). Hóa sinh công nghiệp. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 3. Ngô Xuân Mạnh, Vũ Kim Bảng, Nguyễn ðặng Hùng, Vũ Thy Thư (2006). Giáo trình Hóa sinh thực vật. NXB Nông nghiệp. 4. Lubert Stryer, Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko (2003). Traduit de l’américain par Serge Weinman. Biochimie générale. 5th Edition. Edition Flammaration. 5. P. M. Dey and J. B. Harborne (1997). Plant Biochemistry. Academic press. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………33 Chương 2 VITAMIN Tóm tắt: Vitamin (còn gọi là sinh tố) là những hợp chất hữu cơ, phân tử nhỏ, tự nhiên hoặc tổng hợp, cần với lượng rất nhỏ ñể giúp cho sinh vật hoạt ñộng bình thường, duy trì và phát triển. Dựa theo tính hòa tan, vitamin ñược chia thành hai nhóm lớn: nhóm tan trong mỡ gồm vitamin A, D, E, K, Q và nhóm tan trong nước gồm các loại vitamin B, C, … Nhiều vitamin vitamin tan trong nước là thành phần cấu tạo của các coenzyme khác nhau và tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa vật chất của cơ thể. Các vitamin tan trong mỡ cũng giữ nhiều vai trò quan trọng; ví dụ: vitamin A có chức năng ñặc hiệu trong cơ chế cảm quang của mắt ñộng vật; vitamin D làm tăng sự hấp thu canxi và phospho; vitamin K cần cho quá trình sinh tổng hợp các yếu tố làm ñông máu, nên có tác dụng chống chảy máu; còn vitamin E lại có tác dụng như một chất chống ôxy hóa. 2.1. ðẠI CƯƠNG VỀ VITAMIN Vitamin còn gọi là sinh tố, là yếu tố dinh dưỡng không thể thiếu ñược của mọi sinh vật. Lịch sử phát hiện ra vitamin và ñưa ra khái niệm về vitamin ñã hình thành trong quá trình nghiên cứu về những bệnh liên quan ñến chế ñộ dinh dưỡng của con người. Năm 1753, Lindz (người Anh) ñã nhận ra nguyên nhân gây tử vong cho những người ñi biển lâu ngày là do trong cơ thể thiếu một chất mà thức ăn của họ không có. Nếu dùng thêm chanh hoặc cam, người ta có thể tránh ñược bệnh, mà ngày nay ñược gọi là bệnh hoại huyết (scorbut). Lunin (nhà bác học Nga) năm 1880 ñã cho biết rằng protein, carbohydrate, lipid và các chất khoáng trong khẩu phần ăn hàng ngày chưa ñủ ñể ñảm bảo hoạt ñộng bình thường của người và ñộng vật. Năm 1897, Eijkmann (người Hà Lan) ñã tìm ra nguyên nhân gây bệnh tê phù (beri beri) ở những tù nhân trên ñảo Java (Indonesia) là do trong gạo họ ăn thiếu một chất, mà sau này mới biết là vitamin B1. Năm 1911, Funk (người Ba Lan) ñã tách ñược từ cám gạo hợp chất nói trên. Chất này cần thiết cho sự sống và có nhóm amin trong phân tử, nên ông ñã gọi nó là vitamin (nghĩa là amin của sự sống; vital: sự sống). Nhiều chất phát hiện ra sau này, tuy trong phân tử không có nhóm amin, song khi thiếu chúng ñều gây ra những rối loạn về hoạt ñộng sinh lý bình thường của cơ thể, nên cũng ñược gọi là vitamin. Các nhà khoa học ñã thống nhất một khái niệm chung về vitamin. Vitamin là những hợp chất hữu cơ, phân tử nhỏ, tự nhiên hoặc tổng hợp, cần với lượng rất ít ñể giúp cho sinh vật hoạt ñộng bình thường, duy trì và phát triển. Khái niệm về vitamin cũng chỉ là qui ước. Một chất là vitamin của loài này, song có thể không phải là vitamin của loài khác. Thật vậy, ascorbic acid là vitamin của người và khỉ, song lại không phải là vitamin của chuột; ngược lại p-aminobenzoic acid là vitamin của nhiều loài vi sinh vật, song lại không phải là vitamin của người. Trong tự nhiên, vitamin chủ yếu do thực vật và vi sinh vật tổng hợp nên. Người và ñộng vật có thể tổng hợp ñược một số vitamin, nhưng rất ít, không thoả mãn nhu cầu của cơ thể mà phải ñược cung cấp thêm qua con ñường thức ăn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………34 Người và ñộng vật không nhất thiết phải lấy tất cả các vitamin ở dạng có hoạt tính từ thức ăn. Một vài vitamin có thể ñược cung cấp ở dạng tiền vitamin (provitamin) trong thức ăn. Ví dụ, tiền vitamin A là carotene, có trong rau xanh và một số loại quả chín, ñược ñộng vật chuyển thành vitamin A nhờ enzyme carotenase ñặc hiệu của gan. Trước ñây, khi số lượng vitamin ñược phát hiện ra còn ít, người ta ñặt tên vitamin theo bệnh xuất hiện khi cơ thể thiếu loại vitamin ấy. Khi số lượng vitamin ñược phát hiện càng nhiều, chúng ñược ñặt tên theo vần A, B, C, … Hiện nay, khi người ta ñã biết rõ cấu tạo hóa học và chức năng của hấu hết các vitamin, bên cạnh tên gọi thông thường vitamin còn ñược gọi tên theo bản chất hóa học. Ví dụ: vitamin B1 có tên hóa học là thiamine. Vitamin là những hợp chất hữu cơ rất khác nhau về cấu trúc hoá học, tính chất vật lý, cũng như tác dụng sinh lý ñối với ñộng vật, thực vật và vi sinh vật. Dựa theo tính hòa tan của chúng, vitamin ñược chia thành hai nhóm lớn: • Vitamin tan trong chất béo gồm: A, D, E, K, Q và • Vitamin tan trong nước gồm: các loại B, C, … Các vitamin cùng nhóm thường có một số tính chất giống nhau. Vitamin tan trong chất béo thường ñược hấp thu ở ruột cùng với các chất dầu mỡ trong thức ăn và ñược dự trữ nhiều trong gan. Ngược lại, lượng dự trữ của các vitamin tan trong nước thường rất ít và không ñáng kể. Nhu cầu vitamin không giống nhau ở các ñộng vật khác nhau. Không phải mọi ñộng vật bậc cao ñều cần tất cả các vitamin như nhau. Tùy theo chức năng sinh lý của từng loại vitamin, chúng có vai trò, tác dụng khác nhau ñến sự sinh trưởng phát triển của ñộng vật. Vai trò nổi bật nhất của vitamin tan trong nước là tham gia cấu tạo coenzyme. Nhiều vitamin là thành phần cấu tạo của các loại coenzyme khác nhau và tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa vật chất của cơ thể. Các vitamin tan trong chất béo cũng có những vai trò cực kỳ quan trọng. Ví dụ: vitamin A cần thiết cho sự cảm quang của mắt; vitamin D liên quan ñến trao ñổi canxi, phospho và ñóng vai trò của một hormone; vitamin K có ý nghĩa quan trọng ñối với quá trình ñông máu; còn vitamin E lại có tác dụng chống ôxy hoá. Khi tìm hiểu tác dụng sinh học và bản chất hóa học của vitamin, người ta thấy rằng, có nhiều hợp chất hữu cơ có tác dụng ngược lại với vitamin. Chúng ñược gọi là antivitamin hay kháng vitamin. Các chất này có cấu tạo hoá học gần giống viatmin tương ứng, nhưng không có hoạt tính vitamin. Khi xâm nhập vào cơ thể, các antivitamin thường cạnh tranh với vitamin, ñẩy vitamin ra khỏi coenzyme (phần không phải là protein của enzyme), làm enzyme mất hoạt tính. 2.2. CÔNG THỨC CẤU TẠO VÀ CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA VITAMIN 2.2.1. Vitamin tan trong chất béo Các vitamin tan trong chất béo ñều không phân cực (nonpolar). Trong cơ thể ñộng vật, chúng thường không ñược tổng hợp ñủ nhu cầu, nên cần ñược bổ sung theo con ñường thức ăn và chỉ ñược hấp thu khi sự tiêu hoá và hấp thu mỡ xảy ra bình thường. Khi vào cơ thể, giống như lipid, các vitamin này ñược vận chuyển dưới dạng lipoprotein hay ñược gắn với các protein vận chuyển ñặc hiệu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………35 Hình 2-1. Cấu tạo của vitamin A1 (dạng retinol) Hình 2-2. Cấu tạo của vitamin A1 (dạng retinal)
Hình 2-3. Cấu tạo của β-carotene Vitamin A có 2 dạng là vitamin A1 và vitamin A2. Vitamin A1 gồm dạng aldehyde gọi là retinal và dạng alcol gọi là retinol. Retinal có thể ñược tạo thành từ β-carotene. Có 3 loại carotene là: α-, β- và γcarotene. Chúng bị thủy phân nhờ enzyme ñặc hiệu có trong thành ruột và gan thành vitamin A. βcarotene là một phân tử cân ñối, ñược cấu tạo từ 1 chuỗi prolen và 2 vòng β-ionon ở hai ñầu. Dưới tác dụng của enzyme β-carotene dioxygenase, β- carotene ñược biến ñổi thành 2 phân tử vitamin A (retinal). Còn α- hay γ-carotene, phân tử không cân ñối, nên chỉ chuyển thành 1 phân tử vitaminA. Retinol có thể ñược tạo nên do sự khử chức aldehyde của retinal thành chức rượu dưới tác dụng của retinal reductase có NADH tham gia. Vitamin A2 (3-dehydroretinol) có thêm một liên kết ñôi giữa C3 và C4 của vòng β-ionon. Hiệu lực của vitamin A2 chỉ vào khoảng 40% so với vitamin A1. ðộng vật cần vitamin A ñể sinh trưởng, phát triển và duy trì sức ñề kháng với bệnh tật, bảo vệ sự toàn vẹn của biểu mô. Khi thiếu vitamin A, trẻ em sẽ chậm lớn, thiểu năng, dẫn ñến bệnh khô giác mạc. Vitamin A có chức năng ñặc hiệu trong cơ chế cảm quang của mắt người và ñộng vật. Quá trình thu nhận ánh sáng của mắt phụ thuộc vào một loại protein phức tạp của tế bào que trong võng mạc gọi là rodopsin (chất màu thị giác, có màu ñỏ tía). Rodopsin có cấu tạo gồm 2 phần: phần protein là opsin và phần không phải protein là retinal. Khi ánh sáng chiếu vào võng mạc, rodopsin bị phân giải thành opsin và retinal. Trong tối lại xảy ra quá trình tổng hợp lại rodopsin, do ñó làm tăng ñộ nhạy cảm của mắt ñối với ánh sáng: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………36 Với những ñiều kiện bình thường, trong võng mạc mắt, sự phân giải và tổng hợp rodopsin ñược duy trì ở thế cân bằng, tốc ñộ phân giải và tổng hợp bằng nhau. Khi thiếu vitamin A thì tốc ñộ tái tạo rodopsin chậm lại. Hình 2-4. Cấu tạo của ∆11 – cis - retinal Về ñặc ñiểm và sự chuyển hoá của retinal trong võng mạc, có vài ñiểm cần chú ý. Mạch nhánh của retinal có nhiều nối ñôi, nên chất này có thể tồn tại ở nhiều dạng ñồng phân khác nhau. Tuy nhiên, chỉ có dạng ∆11 – cis - retinal là có cấu trúc không gian thích hợp ñể kết hợp với opsin tạo thành rodopsin, còn các dạng trans-retinal thì không thể kết hợp ñược với opsin. Khi rodopsin bị phân giải, sự hấp thụ ánh sáng ñã gây ra phản ứng ñồng phân hoá, biến dạng ∆11 – cis - retinal thành trans – retinal. Do ñó, trong quá trình này, retinal ñược giải phóng ra ở dạng trans. Trong quá trình tái tổng hợp rodopsin, retinal dạng trans phải ñược ñồng phân hoá trở lại thành dạng ∆11 – cis - retinal nhờ enzyme ñặc hiệu. Một phần retinal dạng trans hình thành khi phân giải rodopsin bị phân giải không thuận nghịch và không ñược chuyển trở lại vào thành phần của rodopsin. Trong võng mạc ñược chiếu sáng, retinal cũng có thể ñược khử thành retinol. Retinal cũng có thể ñược tạo thành từ retinol nhờ enzyme retinen – reductase có coenzyme NAD+ xúc tác. Sự chuyển hoá retinol – retinal có thể ñược biểu diễn như sau: Vitamin A còn tham gia vào quá trình tổng hợp các hormone steroid và làm bền màng tế bào. Sự thiếu hụt vitamin A có thể làm cho da, màng nhày, niêm mạc bị khô, bị sừng hóa và vi khuẩn dễ xâm nhập vào cơ thể. Ở thực vật, khi có ñủ lượng carotene thì sự thụ phấn, thụ tinh mới diễn ra bình thường. Vitamin A chỉ có ở ñộng vật, nhiều nhất là trong dầu cá, bơ, sữa, lòng ñỏ trứng, … Carotene (tiền vitamin A) chỉ có ở thực vật, nhất là cà rốt, cà chua, gấc, ñu ñủ, bầu, bí,... Về nhu cầu, người trưởng thành cần khoảng 5000 IU; phụ nữ có thai và cho con bú cần khoảng 6000 – 8000 IU. ðối với tre em, tuỳ theo tuổi, nhu cầu về vitamin A khác với người lớn. (1 IU tương ñương với hoạt ñộ của 0,6 µg của β-carotene tinh khiết, hoặc 0,3 µg vitamin A alcol. b. Vitamin D (Calciferol) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………37 Các vitamin D ñều là dẫn xuất của các sterol, trong tự nhiên thường gặp chủ yếu ở ñộng vật. Có nhiều loại vitamin D, nhưng hai loại quan trọng nhất trong dinh dưỡng là vitamin D2 và vitamin D3. Hình 2-5. Vitamin D2 (Ergocalciferol) Hình 2-6. Vitamin D3 (Cholecalciferol) Vitamin D2 ñược tạo nên từ tiền chất của nó là ergosterol, chất này thường có ở thực vật và vi sinh vật. Vitamin D3 ñược tạo ra từ 7-dehydrocholesterol, thường có trong dầu cá. Trong cơ thể, vitamin D3 ñược tạo ra từ tiền vitamin D có sẵn dưới da nhờ tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời. Tất cả các loại vitamin D ñều có tác dụng phòng và chống bệnh còi xương, song hiệu lực không giống nhau. Vitamin D2 có tác dụng chống còi xương cho người và chuột, song không có tác dụng ñối với gà con. Trái lại, vitamin D3 có tác dụng ñối với gà con, song lại ít có tác dụng với người và chuột. Vitamin D làm tăng sự hấp thu canxi và phospho ở vách ruột. Thiếu hoặc thừa vitamin D ñều có ảnh hưởng ñến nồng ñộ phospho và canxi trong máu. Khi thiếu vitamin D, trẻ em dễ bị bệnh còi xương và người lớn dễ bị loãng xương. Vitamin D có nhiều trong dầu cá, mỡ bò, lòng ñỏ trứng. Tiền vitamin D có sẵn trong mỡ ñộng vật. Trẻ em, phụ nữ có thai và cho con bú cần 400UI/ ngày (1UI = 0,025 µg cholecalciferol). c. Vitamin E (Tocopherol) Vitamin E cũng có nhiều dạng khác nhau. ðó là các dạng α, β, γ, δ, ... tocopherol, khác nhau bởi số lượng và vị trí của nhóm methyl (-CH3) gắn vào vòng thơm của phân tử. Trong các dạng vitamin E, α-tocopherol có hoạt tính cao nhất. Hình 2-7. Công thức cấu tạo của α-tocopherol Vitamin E có tác dụng như chất chống oxy hóa. Các acid béo không no thường dễ bị ôxy hoá bởi ôxy phân tử. Vitamin E ngăn ngừa ñược quá trình ôxy hoá của các acid béo – loại hợp chất cần thiết cho sự ổn ñịnh và bền vững của màng tế bào. Ngoài ra, vitamin E còn ngăn ngừa sự ôxy hoá của các chất khác như carotene, vitamin A. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………38 Vitamin E cũng tham gia vào quá trình vận chuyển ñiện tử trong các phản ứng ôxy hoá khử và liên quan tới sự giải phóng năng lượng trong các quá trình này. Vitamin E còn tham gia vào việc ñiều hoà quá trình sinh sản. Khi thiếu vitamin E, quá trình tạo phôi bị ảnh hưởng, các cơ quan sinh sản có thể bị thoái hoá. Vitamin E có nhiều ở các loại rau xanh, nhất là xà lách, ở hạt ngũ cốc, dầu thực vật, gan bò, lòng ñỏ trứng, mầm hạt hòa thảo, ... Tỷ lệ vitamin E ñược hấp thu chỉ vào khoảng 50% lượng vitamin E có trong thức ăn. Nhu cầu vitamin E ở ñộng vật phụ thuộc vào giai ñoạn phát triển, lượng acid béo không no trong thức ăn. Người bình thường cần 10-30 mg/ngày. d. Vitamin K Có nhiều loại vitamin K, chúng ñều là những dẫn xuất của naphtoquinon. Vitamin K1 (có nhiều ở thực vật) và vitamin K2 (có nhiều ở ñộng vật và vi khuẩn) khác nhau về ñộ dài của chuỗi isopren; dạng tổng hợp (vitamin K3) có cấu trúc phân tử ñơn giản hơn. Vitamin K (chữ K ñược lấy từ chữ ñầu của từ koagulation, nghĩa là ñông máu) cần cho quá trình sinh tổng hợp các yếu tố làm ñông máu, nên có tác dụng chống chảy máu. Khi thiếu vitamin K, tốc ñộ ñông máu giảm, máu khó ñông. Vitamin K còn tham gia vào sự vận chuyển ñiện tử trong quá trình quang phosphoryl hoá của cây xanh và quá trình phosphoryl hoá ôxy hoá ở ñộng vật. Vitamin K có nhiều trong cỏ linh lăng, bắp cải, rau má, cà chua, ñậu, ngũ cốc, lòng ñỏ trứng và thịt bò, ... Vi khuẩn ñường ruột có khả năng tổng hợp khá nhiều vitamin K. Về nhu cầu, trẻ sơ sinh cần 10-15µg/ngày, người trưởng thành cần dưới 1mg. Hình 2-8. Công thức cấu tạo của vitamin K
(n = 6 -10). Ở ñộng vật có vú, coenzyme Q10 có 10 gốc gốc terpen. Ở thực vật, dạng thường hoạt ñộng là plastoquinone. Ubiquinone (dạng ôxy hoá) Ubiqinol (dạng khử) Hình 2-9. Cấu trúc của vitamin Q Nhờ khả năng biến ñổi thuận nghịch giữa dạng quinone và quinol, các chất này tham gia vào quá trình ôxy hoá khử giữa những dehydrogenase và cytochrome b trong chuỗi hô hấp ở ty thể. Ở thực vật, plastoquinone - một hợp chất tương tự ubiquinone, tham gia vào quá trình quang hợp. Vitamin Q có trong tế bào thực vật, vi sinh vật, ñộng vật và trong các thực phẩm. 2.2. 2. Vitamin tan trong nước a. Vitamin B1 (Thiamine) Vitamin B1 ñược tách ra ở dạng tinh thể vào năm 1912 và người ta ñã xác ñịnh ñược cấu trúc hóa học của nó. Vitamin B1 bền trong môi trường acid, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bị phân hủy khi ñun nóng. Trong cơ thể, vitamin B1 có thể tồn tại ở trạng thái tự do hay ở dạng thiamine pyrophosphate (TPP). TPP có vai trò quan trọng trong quá trình trao ñổi chất của cơ thể. Coenzyme này xúc tác cho quá trình phân giải các ketoacid như pyruvic acid, oxaloacetic acid, .... Vì vậy, khi thiếu vitamin B1, sự chuyển hóa các ketoacid bị ngừng trệ, cơ thể tích lũy một lượng lớn các ketoacid làm rối loạn sự trao ñổi chất và gây nên các trạng thái bệnh lý nguy hiểm, như phù, viêm thần kinh. Hình 2-10. Cấu trúc của vitamin B1 (Thiamine) Vitamin B1 là loại rất phổ biến trong thiên nhiên, ñặc biệt trong nấm men, cám gạo, và mầm lúa mì; trong ñó cám gạo có hàm lượng vitamin B1 cao nhất. Vitamin B1 hòa tan nhiều trong môi trường nước và chịu nhiệt khá nên không bị phân hủy khi nấu nướng. Vitamin B1 ñược tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật. Người và ñộng vật không tổng hợp ñược B1 mà phải thu nhận từ thức ăn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………40 Nhu cầu vitamin B1 phụ thuộc vào chế ñộ ăn, vào trạng thái sinh lý của cơ thể và vào lứa tuối. Người bình thường cần 1-3 mg vitamin B1 trong một ngày. b. Vitamin B2 (Riboflavin) Riboflavin là hợp chất ñược tạo thành do nhân dimetylisoalloxazine kết hợp với một gốc ribityl. Riboflavin bền với nhiệt và acid, song lại nhạy cảm với ánh sáng. Trong cơ thể, riboflavin là thành phần cấu tạo của FMN (flavin mononucleotide) và FAD (flavin adenine dinucleotide) là những nhóm ghép của các dehydrogenase hiếu khí (còn gọi là các flavoprotein) tham gia vào nhiều quá trình chuyển hoá trung gian. Riboflavin còn là thành phần cấu tạo của nhiều oxidase, ñóng vai trò quan trọng trong phản ứng khử nhóm amin của các aid amin. Hình 2-11. Cấu tạo của riboflavin Khi thiếu riboflavin, sự tổng hợp một số enzyme ôxy hoá khử bị ngừng trệ, ảnh hưởng ñến các quá trình ôxy hoá tạo năng lượng cho cơ thể. Riboflavin có khá nhiều trong các sản phẩm ñộng vật và thực vật. Thịt, trứng, sữa, ñậu, rau xanh và mầm các hạt ngũ cốc chứa nhiều riboflavin. Về nhu cầu riboflavin, trẻ em cần từ 0,5-1,5 mg/ngày; người lớn khoảng 1,5 mg/ngày, phụ nữ mang thai và cho con bú cần nhiều hơn: khoảng 1,8-2 mg/ngày. c. Vitamin PP (Nicotinic acid, Nicotinamide) Vitamin PP (còn có tên là niacin hoặc vitamin B3) là hợp chất hữu cơ có tác dụng phòng bệnh Pellagra (pellagra preventive). Cấu tạo hoá học khá ñơn giản, ñó là nicotinic acid hoặc amide của nó là nicotinamide. Ngoài tác dụng chống bệnh Pellgra, vitamin PP còn là thành phần của coenzyme NAD+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) và NADP+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) có trong rất nhiều enzyme dehydrogenase, làm nhiệm vụ vận chuyển hydro, nên có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá (Xem thêm chương 3). Hình 2-12. Cấu trúc của nicotinic acid và nicotinamide Vitamin PP dạng nicotinic acid bền với nhiệt, acid và cả kiềm cho nên khó bị phân huỷ, còn ở dạng nicotinamide lại kém bền với acid và kiềm. Vitamin PP không bị biến ñổi khi nấu nướng, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………41 nên thức ăn qua xử lý vẫn giữ ñược vitamin này. Vitamin PP có nhiều trong gan, thịt nạc, tim, ñặc biệt là nấm men. d. Vitamin B6 (Pyridoxine) Vitamin B6 tồn tại trong cơ thể ở 3 dạng khác nhau: pyridoxol (còn có tên là pyridoxine), pyridoxal và pyridoxamine. Trong quá trình trao ñổi chất của cơ thể, ba dạng này có thể chuyển hóa lẫn nhau. Tuy nhiên, dạng pyridoxal thường chiếm nhiều hơn. Pyridoxal ñược hoạt hoá bởi ATP thành pyridoxalphosphate (PLP), là nhóm ghép của các transaminase và decarboxylase xúc tác cho quá trình chuyển nhóm amin và khử nhóm carboxyl của các aminoacid. Hình 2-13. Cấu trúc của vitamin B6 Vitamin B6 có trong các loại thức ăn từ ñộng vật, thực vật và ñược tổng hợp bởi hệ vi sinh vật ñường ruột của loài nhai lại. Nếu thiếu vitamin B6 sẽ dẫn ñến các bệnh ngoài da, bệnh thần kinh như ñau ñầu, rụng tóc, rụng lông, ... Nhu cầu ở người bình thường 1,5-2mg/ngày. Các ñộng vật nhỏ như gà con cần 3mg/100g thức ăn. e. Vitamin C (Ascorbic acid) Vitamin C là ascorbic acid. Trong cơ thể, vitamin C tồn tại ở 2 dạng: dạng khử là ascorbic acid và dạng ôxy hóa là dehydroascorbic acid. Vitamin C tham gia nhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể. Vì có khả năng nhận và nhường hydro, nên vitamin C thường tham gia các phản ứng ôxy hoá khử của quá trình trao ñổi chất. Vitamin C còn có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp các hormone của tyến thượng thận, của tuyến giáp; cần cho chuyển hoá procollgen thành collagen. Thiếu vitamin C sẽ dẫn ñến bệnh hoại huyết (scorbut): chảy máu răng, chảy máu lưỡi hay nội quan, giảm sức ñề kháng của cơ thể. Vitamin C làm tăng sức ñề kháng của cơ thể ñối với những ñiều kiện bất lợi của môi trường, các ñộc tố khi nhiễm trùng; làm giảm các triệu chứng bệnh lý do tác dụng của phóng xạ. Ngoài ra, vitamin C còn tham gia vào nhiều quá trình khác có vai trò quan trọng trong cơ thể. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………42 (a) (b) Hình 2-14. Cấu trúc của ascorbic acid (a) và dehydroascorbic acid (b) Vitamin C có nhiều trong các loại rau quả tươi, nhất là trong các loại quả có múi như cam, chanh, bưởi, ... Nhu cầu hàng ngày về vitamin C của người bình thường khoảng 80-100 mg. Khi lao ñộng nặng, mang thai, thời tiết lạnh, nhu cầu vitamin C tăng lên. f. Vitamin B12 (Cyanocobalamine) Vitamin B12 có cấu tạo phức tạp, gồm hai thành phần chính là hệ thống vòng trung tâm và một nucleotide. Ngoài ra, trong thành phần cấu tạo còn chứa nhóm cyanid (-CN), Co, amine. Vòng trung tâm có bốn nhân pyrol mang nhiều nhóm thế, bao quanh một nguyên tử Co ở giữa. Nhóm cyanid ñược gắn trực tiếp vào Co và có thể ñược tách ra dễ dàng. Khi CN ñược tách ra, phần còn lại là cobalamine, là thành phần chủ yếu của coenzyme B12. Vitamin B12 giúp cho việc tạo hồng cầu. B12 tham gia các quá trình tổng hợp nucleotide nhờ xúc tác các phản ứng metyl hóa các base nitơ. Thiếu B12 sẽ gây bệnh thiếu máu. Vitamin B12 có nhiều trong các sản phẩm ñộng vật như gan, thận, sữa, phó mát và trứng; hầu như không có trong thực vật bậc cao. ðối với người, chế ñộ ăn hàng ngày cần khoảng 3-5 µg ; nhu cầu tăng lên khi mang thai và khẩu phần ăn chứa nhiều protein thực vật. Hình 2-15. Vitamin B12 (Cyanocobalamine)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………43 Vitamin B5 rất phổ biến ở các ñối tượng sinh vật khác nhau, do ñó có tên là pantothenic acid (theo tiếng Latinh, pantothen: khắp nơi). Phân tử gồm hai thành phần là panthoic acid và β-alanine. Vitamin B5 ngoài tham gia cấu tạo nên coenzyme A vận chuyển acyl, còn là thành phần cấu tạo của ACP (Acyl Carrier Protein) có nhiệm vụ gắn các sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp acid béo. Hình 2-16. Pantothenic acid Pantothenic acid có nhiều ở nấm men, gan, các phần xanh của thực vật và ñược tổng hợp bởi các vi khuẩn ñường ruột. h. Vitamin H (Biotin) ðây là một chất có cấu trúc vòng và một mạch nhánh mang nhóm carboxyl. Biotin thường gắn chặt với apoenzyme nhờ liên kết peptide với nhóm ε-NH2 của lysine, tạo ra phức hợp biotin-enzyme. Biotin là thành phần cấu tạo của các enzyme xúc tác cho các phản ứng carboxyl hóa: tham gia vào các phản ứng hoạt hoá và vận chuyển CO2. Ví dụ: dưới tác dụng của acetyl.CoA carboxylase, nhóm CO2 trên phức hợp biotinenzyme ñược chuyển ñến acetyl.CoA ñể tạo thành malonyl.CoA; ñây là bước mở ñầu của quá trình tổng hợp cid béo ngoài ty thể. Biotin còn tham gia vào quá trình tổng hợp carbamyl phosphate trong chu trình ure, … Hình 2-17. Biotin (a) và carboxybiotin (b) Thiếu biotin sẽ xuất hiện các triệu chứng như sưng da, rụng tóc, ... Biotin có nhiều trong gan bò, lòng ñỏ trứng, sữa, ñậu tương, rau cải, nấm và hành khô,… i. Vitamin Bc (Folic acid) Folic acid bao gồm cả một nhóm chất tương tự nhau về cấu trúc hóa học cũng như tác dụng sinh học. Trong thành phần cấu tạo, các hợp chất này thường gồm có nhân pteridin, paraaminobenzoic acid và glutamic acid, nên ñược gọi tên chung là pteroyl glutamate. Dưới ñây là công thức cấu tạo của hợp chất có một gốc glutamate: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………44 Hình 2-18. Công thức cấu tạo của folic acid Từ folic acid dễ dàng chuyển thành tetrahydrofolic acid (CoF, FH4) là coenzyme của các enzyme xúc tác cho phản ứng vận chuyển các nhóm chứa một carbon (nhưng không phải là CO2) như formal (-CHO), formate (H.COO-) hay hydroxymetyl (-CH2OH). Folic acid có nhiều trong rau xanh, gan, thận và nấm men, ñặc biệt là trong men bia. Nhu cầu hàng ngày của người trưởng thành là khoảng 50 µg. Câu hỏi ôn tập: 1. ðịnh nghĩa và chức năng sinh học chung của vitamin? 2. Kể tên và nêu chức năng sinh học của các vitamin tan trong lipid? 3. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin B1? 4. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin B2? 5. Cấu tạo hoá học và chức năng của pantothenic acid? 6. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin B6? 7. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin B12? 8. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin PP? 9. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin H? 10. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin Bc (folic acid)? 11. Cấu tạo hoá học và vai trò của vitamin C? Tài liệu tham khảo: 1. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1999). Hóa sinh học, Nxb Giáo dục, Hà Nội. 2. Ngô Xuân Mạnh, Vũ Kim Bảng, Nguyễn ðặng Hùng, Vũ Thy Thư (2006). Hoá sinh thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Lê Văn Tri, Nguyễn Ngọc Doãn (1987). Sinh học vitamin. Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 4. Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayers, Victor W. Rodwell (1998). Harperova Biochemie. Translation; Nakladatelství a Vydavatelství H&H, Praha. 5. Nelson D. L., Cox M. M. (2005). Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition. Freeman and Company, New York, USA. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …………………45 Chương 3 ENZYME Tóm tắt: Enzyme là chất xúc sinh học, có tác dụng làm tăng nhanh tốc ñộ các phản ứng hoá sinh. Ngoài một số RNA có khả năng xúc tác, các enzyme có bản chất protein. Enzyme ñơn giản chỉ có các acid amin trong thành phần cấu tạo. Enzyme phức tạp gồm phần protein ñược gọi là apoenzyme và thành phần thứ hai là cofactor (coenzyme, nhóm ghép). Nhiều cofactor là dẫn xuất của vitamin hoặc ion kim loại. Trung tâm hoạt ñộng của enzyme là một vùng tương ñối nhỏ của phân tử, trực tiếp tham gia phản ứng, thực hiện chức năng xúc tác, là nơi gắn cơ chất và chứa các nhóm chức góp phần trực tiếp vào việc cắt ñứt hay hình thành các liên kết ñể tạo ra sản phẩm. Cấu trúc phân tử của enzyme rất phức tạp, gồm nhiều dạng cấu trúc: ñơn nguyên, ña nguyên, phức hợp ña enzyme, ña dạng phân tử, dị lập thể, tiền enzyme, …Các enzyme dị lập thể thường xúc tác cho các phản ứng chủ chốt của một chuỗi phản ứng trao ñổi chất. Enzyme có tính ñặc hiệu cơ chất và theo kiểu phản ứng. Chỉ những cơ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt ñộng của enzyme, mới kết hợp ñựợc với enzyme ñể tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất và phản ứng xúc tác mới xảy ra ñược. Enzyme làm tăng tốc ñộ phản ứng lên rất nhiều lần vì làm giảm năng lượng hoạt hoá của phản ứng. Những phản ứng tương tác xảy ra trong phức hợp E-S ñều kèm theo sự giải phóng một phần năng lượng tự do. ðây là nguồn năng lượng chính ñể ñưa cơ chất vào trạng thái chuyển tiếp tạm thời nên hạ thấp ñược năng lượng hoạt hoá của phản ứng enzyme. Tất cả các yếu tố ảnh hưởng ñến protein và tốc ñộ phản ứng hoá học ñều ảnh hưởng ñến hiệu quả xúc tác của enzyme. Các yếu tố này bao gồm: nồng ñộ enzyme, nồng ñộ cơ chất, pH của môi trường, nhiệt ñộ, các chất hoạt hoá, các chất ức chế, …. Theo phân loại quốc tế, các enzyme ñược chia thành 6 lớp: oxidoreductase, transferase, hydrolase, liase, isomerase và synthetase. Trừ một số trường hợp ngoại lệ, tên enzyme ñều mang ñuôi “ase”. 3.1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN Vấn ñề cung cấp vật chất và năng lượng từ môi trường ngoài, sử dụng chúng trong sinh thể và xây dựng nên các thành phần của tế bào ñược các phản ứng hoá sinh thực hiện. Chính enzyme là chất xúc tác sinh học tham gia ñiều khiển và phối hợp những hệ thống phản ứng hoá sinh ấy. Nhờ enzyme mà các quá trình hoá học trong cơ thể sống xảy ra rất nhạy và rất nhanh trong những ñiều kiện sinh lý bình thường. Lịch sử của Hoá sinh học phần lớn gắn liền với lịch sử các nghiên cứu về enzyme. Từ thế kỷ 18 ñã có những thông tin về xúc tác sinh học; người ta ñã mô tả tác dụng tiêu hoá của dịch dạ dày. Khi Berzelius (1834) viết rằng trong cơ thể ñộng vật và thực vật luôn diễn ra hàng nghìn phản ứng ñược xúc tác, hẳn ñã linh cảm thấy sự tồn tại của các enzyme. Vào những năm 50 của thế kỷ 19, Pastuer ñã cho biết sự lên men ñường thành rượu ở tế bào men ñược xúc tác bởi các “ferment”. Song, vì theo trường phái “sinh lực”, ông cho rằng các “ferment” này không thể tách rời khỏi các cấu trúc của tế bào và quan ñiểm này kéo dài hàng mấy chục năm. Năm 1897, Büchner cho biết các chất chiết từ tế bào men cũng lên men ñường thành rượu; ñiều này chứng tỏ sự lên men rượu ñược xúc tiến bởi các phân tử có thể hoạt ñộng chức năng ngay cả khi ñược tách khỏi tế bào. Kühne gọi các phân tử ñó là enzyme. Thuyết sinh lực bị bác bỏ, và từ ñó nhiều enzyme ñược phân lập và nghiên cứu ñã thúc ñẩy Sinh hoá học phát triển. Năm 1926, Sumner phân lập, kết tinh ñược urease và chứng minh ñược bản chất protein của nó. Song, chỉ ñến những năm 30 của thế kỷ 20, kết luận của Sumner mới ñược công nhận Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 46 rộng rãi, sau khi Northrop và Mores kết tinh ñược pepsin, trypsin và các enzyme tiêu hoá khác và cho biết chúng cũng là protein. Từ cuối thế kỷ 19 và ñầu thế kỷ 20 ñã có những ý tưởng ñầu tiên về cơ chế xúc tác của enzyme: thuyết bổ sung (Fischer, 1894), thuyết lập hợp chất trung gian enzyme-cơ chất (Henry, 1902), ñộng học của các phản ứng enzyme (Michaelis-Menten, 1913). Từ năm 1926, khi bản chất protein của enzyme ñược khám phá, các nghiên cứu về enzyme ñã ñạt ñược những thành tựu ñáng kể. Cho tới nay, trên 3000 enzyme ñã ñược mô tả một cách chi tiết, trong ñó nhiều enzyme ñã ñược phân lập. Người ta ñã khám phá ra cấu trúc bậc nhất, các bậc cấu trúc không gian và mô tả khá chi tiết cơ chế tác ñộng của nhiều enzyme. Hiện nay, “Enzyme học” ñã hình thành và trở thành ngành khoa học mũi nhọn của sinh học phân tử. Công nghệ enzyme ñã trở thành nền tảng và là một bộ phận của công nghệ gen nói riêng và của công nghệ sinh học nói chung. 3.1.1. Khái niệm chung về sự xúc tác Xúc tác là một hiện tượng khá quen thuộc trong hoá học. Chất xúc tác là chất làm tăng tốc ñộ các phản ứng hoá học, nhưng sau phản ứng thường không bị biến ñổi, tiêu hao và không tham gia vào thành phần của sản phẩm. Một phản ứng hoá học chỉ có thể xảy ra ñược khi các cơ chất ñược hoạt hoá; các cơ chất phải ñược cung cấp năng lượng, ñể ñạt ñược mức năng lượng cần thiết cao hơn mức bình thường ñể có thể làm ñứt liên kết cũ, tạo liên kết mới. Năng lượng cần thiết phải cung cấp ñể phản ứng có thể xảy ra ñược, ñược gọi là năng lượng hoạt hoá. Một phản ứng ñòi hỏi mức năng lượng hoạt hoá càng cao thì tốc ñộ diễn ra càng chậm. Các chất xúc tác, theo những cơ chế khác nhau, làm giảm năng lượng hoạt hoá của các phản ứng hoá học, và do ñó, làm tăng nhanh tốc ñộ phản ứng hoặc làm cho phản ứng có thể xảy ra trong ñiều kiện mà nếu thiếu nó sẽ không xảy ra ñược. Các chất xúc tác có thể làm giảm năng lượng hoạt hoá của các phản ứng hoá học theo những cơ chế khác nhau. Thông thường, chất xúc tác kết hợp với cơ chất ñể tạo phức hợp trung gian, sau ñó phức hợp này trải qua những chuyển hoá tiếp theo, ñể cuối cùng tạo nên sản phẩm của phản ứng và giải phóng chất xúc tác. Một ñiều cần chú ý là: chất xúc tác không làm thay ñổi chiều phản ứng, không tạo ra ñược phản ứng mà về mặt nhiệt ñộng học không cho phép xảy ra. Trong phản ứng thuận nghịch, chất xúc tác chỉ làm phản ứng chóng ñạt tới trạng thái cân bằng mà không làm dịch chuyển vị trí của thế cân bằng. 3.1.2. Enzyme là chất xúc tác sinh học Enzyme là chất xúc tác sinh học, có tác dụng làm tăng nhanh tốc ñộ của các phản ứng hoá sinh. Enzyme có ñầy ñủ những tính chất cơ bản của chất xúc tác. Enzyme có mặt trong mọi sinh thể; ngay cả những tế bào ñơn giản nhất cũng chứa hàng nghìn enzyme. Vì enzyme, cũng như các protein khác, còn có tính ñặc hiệu theo loài (mỗi loài có các enzyme ñặc trưng riêng), nên số lượng enzyme trong sinh giới phải lên tới hàng tỷ. Enzyme, cũng giống như các chất xúc tác hoá học khác, chỉ làm tăng tốc ñộ phản ứng mà không tham gia vào sản phẩm cuối cùng của phản ứng, bởi vì nó làm tăng tốc ñộ cả hai chiều phản ứng, làm cho phản ứng chóng ñạt tới trạng thái cân bằng. Quá trình trao ñổi chất rất phức tạp và có những yêu cầu về chất lượng các chất xúc tác; bởi vì các phản ứng diễn ra có mục ñích theo một kế hoạch chính xác. Do ñó, enzyme phải ñảm bảo quá trình phản ứng sao cho không có sản phẩm phụ và hoạt ñộng trong mối liên quan, phối hợp với nhau. Hoạt tính của enzyme có thể ñược ñiều chỉnh một cách linh hoạt theo nhu cầu thay ñổi của cơ thể. Các chất xúc tác sinh học mà sinh giới ñã tạo ra sau hàng tỷ năm phát triển, nên hoàn thiện hơn so với các chất xúc tác hoá học dùng trong phòng thí nghiệm. Enzyme có ưu ñiểm hơn các chất xúc tác hoá học thông thường về những mặt sau ñây: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 47 - Hiệu quả xúc tác của enzyme vô cùng lớn. Một phân tử enzyme có thể làm biến ñổi hàng vạn hoặc nhiều hơn phân tử cơ chất trong vòng 1 phút. Enzyme làm tăng tốc ñộ phản ứng lên nhiều lần so với chất xúc tác vô cơ; ñiều này ñược thể hiện qua phản ứng sau: 2H2O2 → 2H2O + O2 Trong phản ứng trên, khi không có chất xúc tác, tốc ñộ phản ứng chỉ ñạt 0,23/s; khi có Pt xúc tác, tốc ñộ phản ứng là 1,3.103/s; còn khi có enzyme catalase xúc tác, tốc ñộ phản ứng ñạt tới 3,7.107/s. - Enzyme có tính ñặc hiệu theo kiểu phản ứng và cơ chất. - Xúc tác enzyme diễn ra trong những ñiều kiện môi trường tương ñối ổn ñịnh (to khoảng 20- 40o C, áp suất khoảng 1 at, pH ≈ 7). - Tác dụng của enzyme có thể ñược ñiều khiển và hơn nữa còn ñược ñiều khiển ở nhiều mức. Tuy có những ưu ñiểm trên, song các enzyme lại thường có cấu trúc rất phức tạp và rất mẫn cảm với hàng loạt yếu tố. Mặt khác, các enzyme thường xuyên ñược sử dụng rất nhiều, song lại luôn bị phân giải và tổng hợp mới trở lại theo nhu cầu. 3.1.3. ðơn vị hoạt lực của enzyme Không phải lúc nào người ta cũng có thể xác ñịnh ñược nồng ñộ của các enzyme, trong nhiều trường hợp chỉ xác ñịnh ñược ñơn vị hoạt lực của chúng. Năm 1961, Hội Hoá sinh quốc tế (IUB) ñã ñưa ra ñơn vị hoạt lực enzyme chuẩn: 1U là lượng enzyme cần ñể biến ñổi 1 µmol cơ chất trong thời gian 1 phút ở ñiều kiện chuẩn (30o C, pH tối ưu, bão hoà cơ chất). Năm 1972, người ta lại dùng ñơn vị katal (kat) ñể biểu diễn hoạt lực enzyme. 1kat là lượng chất xúc tác làm biến ñổi 1 mol cơ chất trong thời gian 1 giây ở ñiều kiện chuẩn (µkat = 10 -6 kat; ηkat = 10 -9 kat). Liên hệ giữa hai ñơn vị cũ (U) và mới: U = 16,67 ηkat). 3. 2. CẤU TẠO CỦA ENZYME 3.2.1. Phần lớn các enzyme có bản chất là protein Trừ một số RNA có khả năng xúc tác (gọi là các ribozyme hay riboenzyme), các enzyme ñều có bản chất là protein. Enzyme là những protein hình cầu, phần lớn có bản chất là protein phức tạp. Enzyme ñầu tiên ñược xác ñịnh cấu trúc bậc nhất (năm 1960) là ribonuclease tụy bò, phân tử là một chuỗi polypeptide, gồm 124 acid amin, với 4 cầu disulfide; tiếp theo là cytochrome c (năm 1962), chứa nhóm hem ñược gắn với chuỗi polypeptide có 104 acid amin. ðến nay, người ta ñã biết về cấu tạo của hàng nghìn enzyme và nhận thấy enzyme cũng có nguyên tắc cấu tạo, có các bậc cấu trúc và các tính chất như những protein khác. Khối lượng phân tử của enzyme dao ñộng từ hàng chục nghìn ñến hàng triệu dalton. Ví dụ: ribonuclease có khối lượng phân tử là 12.000 dalton; glutamate dehydogenase và urease có khối lượng phân tử tương ứng là 1.000.000 và 483.000 dalton. Cũng như các protein khác, enzyme tan trong nước hoặc trong dung dịch muối loãng. Do kích thước phân tử lớn, nên các enzyme cũng không qua ñược màng bán thấm. Tất cả các yếu tố làm biến tính protein (acid ñặc, kiềm ñặc, muối kim loại nặng, nhiệt ñộ cao, …) ñều có thể làm enzyme bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác. Các chất gây kết tủa thuận nghịch protein (amon sulfat, natri clorua, các dung môi hữu cơ ở nhiệt ñộ thấp) cũng có tác ñộng tương tự tới các chế phẩm enzyme. Vì vậy, có thể dùng các chất này ñể kết tủa và phân lập enzyme. Tuỳ theo pH môi trường, enzyme cũng có thể mang ñiện dương, ñiện âm hay trung hoà về ñiện. Do ñó, có thể ñiện di ñể phân tích các loại enzyme và các dạng phân tử enzyme. Các enzyme cũng ñều ñược tổng hợp nên dưới sự ñiều khiển của các hệ gien. Cơ chế sinh tổng hợp enzyme cũng chính là cơ chế sinh tổng hợp protein. Xét về cấu trúc, có hai loại enzyme: ñơn giản và phức tạp. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 48 Enzyme ñơn giản (enzyme một thành phần): là những enzyme thuần tuý chỉ có các acid amin trong thành phần cấu tạo. Các enzyme thuỷ phân (ví dụ: amylase, pepsin, trypsin, …) thường nằm trong nhóm này. Các enzyme ñơn giản không ñòi hỏi các nhóm hoá học khác cho hoạt ñộng xúc tác ngoài các gốc acid amin của chúng. Enzyme phức tạp (enzyme hai thành phần) gồm: phần protein enzyme (gọi là apoenzyme) và phần không có bản chất protein (gọi là cofactor). Apoenzyme kết hợp với cofactor tạo thành một phân tử enzyme hoàn chỉnh (holloenzyme) có khả năng xúc tác. 3.2.2. Các cofactor Cofactor là cấu trúc nhỏ, không ñược cấu tạo từ các acid amin và là thành phần của enzyme phức tạp, làm nhiệm vụ chuyển các nguyên tử hay ñiện tử trong phản ứng hoá học mà enzyme của nó xúc tác. Loại cofactor liên kết chặt chẽ với protein enzyme, là thành phần cố ñịnh của phân tử, thường ñược gọi là nhóm ghép (prosthetic group), ví dụ FAD, FMN của một số dehydrogenase, PLP của aminotransferase, hem của các cytochrome, ... Còn các cofactor gắn lỏng lẻo với apoenzyme, dễ tách ra và kết hợp với phần này, thường ñược gọi là coenzyme, ví dụ NAD+, NADP+. Bảng 3-1. Một số cofactor là dẫn xuất của vitamin Cofactor NAD+, NADP+ FMN, FAD Pyridoxal phosphate (PLP) Thiamine pyrophosphate (TPP) Coenzyme A (CoA.SH) Biocytin Vitamin tương ứng PP (Nicotinic acid, niacin) Riboflavin (B2) Pyridoxine (B6) Thiamine (B1) Pantothenic acid (B5) Biotin Nhóm vận chuyển H+, eeamine aldehyde acyl CO2 Rất khó phân biệt nhóm ghép và coenzyme, nên ñôi khi người ta dùng lẫn lộn các thuật ngữ này. Hơn nữa, nhóm ghép bao gồm tất cả các cấu trúc gắn với protein, kể cả cấu trúc không có chức năng xúc tác (ví dụ nhóm hem của hemoglobin, phần saccharide của glycoprotein). Tuy nhiên, coenzyme và nhóm ghép khác nhau về cách tái tạo lại, tức là cách chuyển về nguyên dạng của nó, sau khi ñã hoàn thành chức năng xúc tác. Thực ra, các coenzyme ñóng vai trò như một cơ chất thứ hai. Coenzyme và cơ chất cùng tham gia một phản ứng. Sau phản ứng ñó, coenzyme lại chuyển sang một apoenzyme khác, phản ứng với cơ chất tiếp theo và thông qua ñó nguyên dạng của nó ñược tái tạo. Enzyme có nhóm ghép hoạt ñộng hơi khác: phản ứng liên tục với hai cơ chất khác nhau, trong ñó hai phản ứng ñều do enzyme ấy xúc tác. Bản chất hoá học của các cofactor rất khác nhau. Rất nhiều coenzyme có cấu trúc của một nucleotide ñơn hoặc ñôi. Nhiều cofactor là dẫn xuất của các vitamin tan trong nước. Bảng 3-1 ñưa ra một số cofactor là dẫn xuất của các vitamin khác nhau. Các hình 3-1, 3-2 và 3-3… mô tả cấu trúc và cơ chế hoạt ñộng của một số cofactor. a. Một số cofactor của các enzyme ôxy hoá khử - NAD+(Nicotinamide Adenine Dinucleotide) và NADP+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate): Phân tử cấu tạo từ 2 nucleotide nối với nhau nhờ phosphoric acid, là dẫn xuất của vitamin PP (nicotinamide, niacin). Có khoảng 250 enzyme dehydrogenase làm việc với NAD+ hay NADP+. Một trong hai H+ ñược tách ra từ cơ chất sẽ gắn vào vị trí thứ 4 trên vòng pyridine, H+ thứ hai gắn với apoenzyme. (Nguyên tử N trong vòng pyridine chưa bão hoà ñiện tử, nên có dấu + ñi kèm). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 49 Hình 3-1. Cấu trúc và cơ chế hoạt ñộng của NAD+ và NADP+ Hình 3-2. Cấu trúc và cơ chế hoạt ñộng của FMN và FAD Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 50 - FMN (Flavin mononucleotide) và FAD (Flavin Adenine Dinucleotide): là dẫn xuất của riboflavin (vitamin B2). Chúng liên kết chặt chẽ với apoenzyme, tạo thành các flavoprotein. Thực ra FMN và FAD không phải là các nucleotide vì vòng isoalloxazine không gắn với ribose mà gắn với ribotol, hơn nữa hai thành phần này cũng không gắn với nhau bằng liên kết glycoside. Các flavoprotein cũng tham gia vận chuyển hydro trong các phản ứng ôxy hoá khử. Chúng nhận hydro từ các NADH, NADPH hoặc tham gia tách hydro của cơ chất ñể tạo nên nối ñôi. Khác với NAD+ và NADP+, chúng tham gia cả phản ứng vận chuyển ôxy và vận chuyển một ñiện tử. Các dạng ôxy hoá (FAD, FMN) có màu vàng. Lõi hoạt ñộng của hai nhóm ghép này là vòng isoalloxazine. - Coenzyme Q (Ubiquinone): làm nhiệm vụ vận chuyển hydro, là thành viên của chuỗi hô hấp. Có nhiều loại coenzyme Q, chúng ñều có một mạch nhánh dài gồm nhiều gốc terpen (n = 6-10). Ở ñộng vật có vú, coenzyme Q10 có 10 gốc gốc terpen. Hình 3-3. Cấu trúc và hoạt ñộng của coenzyme Q - Có nhiều enzyme cần cofactor là nhóm hem. Ví dụ: các cytochrome, catalase, peroxidase và một số oxidase. Nhóm hem vận chuyển ñiện tử nhờ khả năng biến ñổi thuận nghịch của Fe2+ và Fe3+ : - Lipoate (acid lipoic): gắn với apoenzyme nhờ liên kết peptide hình thành giữa COOH của nó và nhóm NH2 ở Cε của một gốc lysine trong apoenzyme. Khi nhận hydro của cơ chất, vòng disulfide mở ra và tạo thành hai nhóm thiol (SH). Enzyme chứa lipoate tách hydro của một aldehyde và tạo ra một carboxylic acid. ðây là một phản ứng trong quá trình khử carboxyl ôxi hoá của các ketoacid. Hình 3-4. Cấu tạo của lipoic acid
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 51 trình vận chuyển, các acyl ñược gắn vào nhóm thiol (-SH) của cysteamine nhờ liên kết thioester. Hình 3-5. Cấu trúc của coenzyme A (CoA.SH) - Thiamine pyrophosphate (TPP): là dẫn xuất của vitamin B1 (thiamine). Phần tham gia phản ứng là vòng thiazol, còn vòng pyrimidine và nhóm diphosphate làm nhiệm vụ gắn với apoenzyme. Enzyme có TPP xúc tác cho phản ứng khử carboxyl của các ketoacid, là thành viên của tổ hợp ña enzyme làm nhiệm vụ khử carboxyl ôxy hoá tạo ra các acid ngắn ñi 1C hoặc các thioester. Hình 3-6. Cấu trúc của thiamine pyrophosphate (TPP) - Pyridoxal phosphate (PLP): là dẫn xuất của vitamin B6, là nhóm ghép của các transaminase xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm amin, ñồng thời cũng là nhóm ghép của các decarboxylase khử nhóm carboxyl của các acid amin. Ngoài NAD(P+), ñây là cofactor thứ hai có nhân pyridine. Tất cả các nhóm chức ngoài nhân pyridine ñều gắn với apoenzyme, nhưng quan trọng nhất là 5'-phosphate. Hình 3-7. Cấu trúc của pyridoxal phosphate Một số enzyme lại cần các yếu tố khác như các ion kim loại (Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+,…) ñể có khả năng xúc tác. Các ion này ñóng vai trò là chất phối hợp (cofactor) trong hoạt ñộng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 52 xúc của enzyme (Bảng 3.2). Các enzyme có kim loại trong thành phần cấu tạo thường ñược gọi là metaloenzyme. Bảng 3-2. Một số ion kim loại có vai trò là cofactor Ion kim loại Cu2+ Fe2+ hay Fe3+ K+ Mg2+ Zn2+ Enzyme Cytochrome oxidase Cytochrome oxidase, catalase, peroxidase Pyruvate kinase Hexokinase, glucose-6-phosphatase Carbonic anhydrase, alcol dehydrogenase Các ion kim loại trong enzyme còn làm nhiệm vụ liên kết giữa enzyme với cơ chất, liên kết giữa enzyme với coenzyme khác. Ví dụ Mn2+ nối aminopeptidase với cơ chất peptide, Zn2+ nối coenzyme NAD+ với alcol dehydrogenase và cơ chất. Fe trong các cytochrome và peroxidase có thể trực tiếp tham gia vận chuyển ñiện tử, … 3.2.3. Trung tâm hoạt ñộng của enzyme Enzyme có bản chất là protein nên cấu hình không gian của toàn bộ phân tử ñóng vai trò quan trọng ñối với hoạt tính xúc tác của nó. Theo Fischer, chỉ một vùng tương ñối nhỏ của phân tử enzyme trực tiếp tham gia phản ứng, thực hiện chức năng xúc tác. ðây là nơi gắn cơ chất và chứa các nhóm chức góp phần trực tiếp vào việc cắt ñứt hay hình thành các liên kết ñể tạo ra sản phẩm. Vùng này ñược gọi là trung tâm hoạt ñộng (TTHð) của enzyme. Khả năng xúc tác, tính ñặc hiệu và một số tính chất khác của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào TTHð của nó. TTHð của enzyme thường bao gồm những gốc acid amin với nhóm hoá học có hoạt tính cao như serine (OH), histidine (imidazol), cysteine (SH), lysine (ε-NH2), glutamate (COOH),… Các nhóm chức tạo nên TTHð của enzyme ñôi khi khá xa nhau trên chuỗi polypeptide, có thể trên các chuỗi khác nhau. Tuy nhiên, chúng lại gần nhau trong không gian (nhờ cấu trúc bậc cao), ñược phân bố, ñịnh hướng một cách chính xác ñể cùng phối hợp thực hiện chức năng xúc tác của enzyme. Hình 3-8. Trung tâm hoạt ñộng của enzyme có cấu trúc bổ sung thích hợp với cơ chất Các nhóm chức năng tham gia cấu tạo TTHð có các nhiệm vụ sau: một số nhóm gắn cơ chất (tạo vùng liên kết), một số nhóm xúc tác tích cực (tạo vùng xúc tác), một số nhóm tạo môi trường và cấu trúc không gian thích hợp cho TTHð. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp, người ta còn nhận thấy vai trò của của một số ion kim loại trong TTHð. Ở các enzyme phức tạp có coenzyme, TTHð còn có vùng liên kết với coenzyme, và các nhóm chức năng của coenzyme cũng ñược coi là thành phần cấu tạo của TTHð. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 53 Có những enzyme có một TTHð, song cũng có những enzyme có hai hay nhiều TTHð. Các TTHð của một phân tử enzyme có thể giống nhau, nhưng cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chức năng, do ñó một phân tử enzyme có thể xúc tác nhiều phản ứng hoá học khác nhau. Chỉ những cơ chất ñặc hiệu, có cấu trúc phân tử thích hợp với TTHð của enzyme mới tạo ra ñược phức hợp enzyme-cơ chất (ES) và quá trình xúc tác chỉ xảy ra khi cơ chất ñược gắn vào TTHð của enzyme. Theo Ficher (1890), TTHð của enzyme ñã ñược hình thành sẵn với một cấu tạo nhất ñịnh và chỉ kết hợp với những cơ chất có cấu trúc bổ sung thích hợp. Có thể coi sự thích ứng ñó như « ổ khoá» và «chìa khoá». Thuyết này phần nào giải thích ñược tính ñặc hiệu của enzyme. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng TTHð không phải hình thành sẵn trên phân tử enzyme mà nó chỉ ñược hình thành khi có sự tác ñộng tương hỗ giữa enzyme và cơ chất. Kosland (1958) ñã ñưa ra thuyết «tiếp xúc cảm ứng» ñể giải thích cơ chế này. Theo tác giả này, TTHð khá mềm dẻo và linh hoạt, các nhóm chức năng trong TTHð của enzyme tự do chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt ñộng. Khi có sự tiếp xúc với cơ chất, chính cơ chất ñã gây cảm ứng, làm biến ñổi hình dạng phân tử enzyme, làm cho các nhóm chức năng của TTHð ñược ñịnh hướng một cách thích hợp và chính xác ñể gắn với cơ chất. Như vậy, TTHð của enzyme thực sự ñược hình thành trong quá trình tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Bên cạnh TTHð, trong phân tử enzyme còn có những vùng có ý nghĩa, chức năng khác. ðó là vùng gắn những chất có khả năng làm biến ñổi hoạt tính xúc tác của enzyme. Hoạt tính của các enzyme ñóng vai trò mấu chốt trong các quá trình trao ñổi lại ñược ñiều khiển bởi các chất gây hiệu ứng dị lập thể (allosteric effectors). ðây là những chất có khả năng làm biến ñổi cấu hình enzyme và do ñó ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Nơi tác dụng, nơi gắn các chất gây hiệu ứng này gọi là trung tâm ñiều khiển hay trung tâm dị lập thể (allosteric center). 3.2.4. Các tổ hợp ña enzyme và các enzyme dị lập thể Nhiều phân tử enzyme chỉ là một chuỗi polypeptide (ñơn nguyên). Tuy nhiên, rất nhiều enzyme có cấu trúc bậc 4, do nhiều chuỗi polypeptide giống nhau hoặc khác nhau tổ hợp lại. ðây là những enzyme oligomer (ña nguyên), thường có từ hai ñến bốn chuỗi, song cũng có thể có nhiều chuỗi polypeptide. Các enzyme này sẽ thay ñổi hoạt tính xúc tác khi các chuỗi phân ly, tách rời nhau. Phần lớn các enzyme làm việc trong một dây chuyền phản ứng, nghĩa là sản phẩm của một phản ứng enzyme là cơ chất cho phản ứng tiếp theo. Chuỗi phản ứng ấy có thể ñược thực hiện nhờ nhiều enzyme trong một tổ hợp. Trong một tổ hợp ña enzyme (multienzyme complex), các enzyme nối với nhau nhờ các liên kết phụ hay liên kết ñồng hoá trị. Các ñơn vị thường sắp xếp sao cho có một chất chuyển chung với cánh tay ñòn linh ñộng có khả năng chuyển sản phẩm trung gian từ TTHð của một enzyme tới TTHð của enzyme bên cạnh. Ví dụ: Tổ hợp pyruvte dehydrogenase (xúc tác sự khử carboxyl ôxy hoá biến pyruvate thành acetyl.CoA) có 5 cofactor và 3 enzyme hoạt ñộng liên hoàn với nhau (xem Hình 6-36, chương 6). Trong tổ hợp ña enzyme tổng hợp acid béo, ACP (Acyl Carrier Protein) nằm ở trung tâm, là protein gắn các acyl - sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp (xem chương 7). Cấu trúc bậc cao của enzyme tạo ra các tính chất mới mà các cấu trúc bậc thấp không có. Phân tử có nhiều tiểu phần tạo ra khả năng ñiều khiển hoạt tính xúc tác một cách linh hoạt và hiệu quả. Các tổ hợp ña enzyme tạo ñiều kiện ñể cơ chất ñược biến ñổi ở nhiều mức (tương tự như một dây chuyền sản xuất). Các SPTG chuyển từ một TTHð sang TTHð tiếp theo mà không bị giải phóng ra khỏi khu vực phản ứng và như vậy không bị dồn ñống lại, ñồng thời quá trình xúc tác lại xảy ra cực nhanh. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 54 Các phản ứng trong TTHð có thể xảy ra theo kiểu không ñối xứng (asymetric): cơ chất gắn với cấu trúc ở một phía và phần tách ra khỏi phức hợp E-S từ phía bên kia. ðây là các tổ hợp véc-tơ (có ñịnh hướng). Ví dụ: khi tổ hợp Na+, K+-ATPase thuỷ phân ATP, các ion Na+ và K+ sẽ ñược dịch chuyển qua màng theo theo hai chiều ngược nhau, Na+ ñi ra khỏi tế bào còn K+ vào trong. Sự chuyển dịch ngược chiều của các ion này là một phản ứng có hai bước diễn ra trong TTHð của tổ hợp gồm hai tiểu ñơn vị xúc tác và vận chuyển ñược neo trong màng tế bào. Các tổ hợp ña enzyme của chuỗi hô hấp (ở màng trong ty thể) xúc tác cho quá trình vận chuyển ñiện tử từ cơ chất tới ôxy. Nhờ sự ñịnh hướng không gian thích hợp của từng thành phần, hợp diễn với quá trình vận chuyển ñiện tử, các proton ñược bơm qua màng, làm hình thành một gradient H+. ðây là ñộng lực làm biến ñổi năng lượng giải phóng ra trong quá trính vận chuyển ñiện tử thành năng lượng ATP ñược tạo ra trong quá trình phosphoryl hoá ôxy hoá (Xem thêm chương 6). Trong quá trình trao ñổi chất, một số enzyme có tác dụng ñiều chỉnh then chốt, thường ñược gọi là các enzyme ñiều khiển (regulatary enzyme) hay enzyme dị lập thể (allosteric enzyme). Ngoài TTHð làm nhiệm vụ xúc tác, các enzyme này còn có trung tâm ñiều khiển hay trung tâm dị lập thể, làm nhiệm vụ ñiều chỉnh hoạt tính của enzyme. Tuy có dụng tương hỗ nhau, song hai trung tâm này có cấu trúc khác biệt nhau và ñịnh vị ở những khu vực khác nhau trên phân tử enzyme. Các enzyme dị lập thể thường xúc tác cho các phản ứng chủ chốt của một chuỗi phản ứng trao ñổi chất. Hoạt tính xúc tác của chúng không những chịu sự chi phối của nồng ñộ cơ chất, mà còn ñồng thời chịu tác dụng ñiều chỉnh của các chất chuyển hoá, thường là sản phẩm của quá trình chuyển hoá mà enzyme ñó tham gia xúc tác. Các enzyme dị lập thể thường tồn tại ở hai dạng có hình dáng và hoạt tính xúc tác khác nhau: dạng hoạt ñộng và dạng không hoạt ñộng. Sự chuyển ñổi giữa hai dạng trên xảy ra khi yếu tố gây hiệu ứng gắn vào trung tâm dị lập thể. Lúc ñó hình dáng không gian của phân tử enzyme thay ñổi, làm TTHð thay ñổi và hoạt tính xúc tác của enzyme cũng thay ñổi theo. Chất hoạt hoá thường làm cho cơ chất thuận lợi và dễ dàng bám vào TTHð và làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme. Còn chất ức chế thường làm giảm hoặc làm mất khả năng xúc tác của enzyme. Hoạt tính xúc tác của loại enzyme này ñược ñiều hoà theo cơ chế như vậy. Hình 3-9. Chất ức chế làm mất hoạt tính xúc tác của enzyme 3.2.5. Sự phân bố và các dạng enzyme a. Enzyme nội bào và enzyme ngoại bào Theo vị trí tác ñộng, các enzyme ñược chia thành enzyme nội bào và enzyme ngoại bào. Các enzyme nội bào chiếm số ñông, có mặt và thực hiện chức năng bên trong tế bào nơi ñã sản sinh ra chúng. Chúng hoạt ñộng chức năng ở dạng hoà tan hay ở dạng kết hợp trong các Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 55 cấu trúc sinh học và tạo ra các tổ hợp ña enzyme. Nhiều enzyme nội bào chỉ có trong một số mô bào hay bào quan nhất ñịnh. Các enzyme ngoại bào ñược tế bào sản sinh ra nó tiết ra bên ngoài, có mặt trong các dịch bào như dịch tiêu hoá, dịch não tuỷ và trong máu. Một số vi sinh vật cũng tiết enzyme (thuỷ phân các chất dinh dưỡng) vào môi trường nuôi cấy. Hình 3-10. Sự hoạt hoá các zymogen nhờ các protease ñặc hiệu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 56 nhau, ñược mã hoá bởi các gen khác nhau). Các dạng phân tử khác nhau ấy của một enzyme ñược gọi là các isozyme hay isoenzyme. Isozyme có thể là các dạng khác nhau của một enzyme ñược thay thế dần trong quá trình phát triển của cơ thể hay các dạng ñảm nhiệm những vai trò giống nhau ở những mô bào khác nhau của cơ thể. Chúng có thể là sản phẩm của các gen ñộc lập (ví dụ malate dehydrogenase của ty thể và malate dehydrogenase của tế bào chất) hay có thể ñược ñiều khiển bởi các ñoạn DNA khác nhau. Ở enzyme có các tiểu phần khác nhau, isozyme là dạng lai tạo (hybride) khác nhau. Ví dụ ñiển hình là lactate dehydrogenase (LDH), phân tử là một oligomer có 4 tiểu phần thuộc hai dạng H và M. Các tiểu phần này có thể kết hợp tạo ra 5 isozyme: H4, H3M1, H2M2, H1M3 và M4. Các dạng này chiếm tỷ lệ khác nhau ở những mô khác nhau. Các isozyme có thể ñược phân bố trong các khoang tế bào, và ở ñó xúc tác các phản ứng giống nhau trong các quá trình trao ñổi khác nhau. Sự tồn tại các dạng enzyme ñặc hiệu trong mô bào với những tính chất xúc tác và ñiều hoà ñược biến ñổi làm sinh vật có thể thích nghi với những ñiều kiện thay ñổi của môi trường. Ví dụ: LDH dạng M4 có khả năng rất cao trong việc chuyển pyruvate thành lactate, ngược lại ở H4 khả năng này lại thấp. Do ñó, mô bào nào ñược cung cấp ñều ñặn và ñầy ñủ ôxy (ví dụ cơ tim), bình thường không tạo lactate, chứa nhiều LDH dạng H4. Ngược lại, cơ vân có thể bị thiếu ôxy, lại cần dạng M4 (M = muscle, cơ; H = heart, tim). 3.3. TÍNH ðẶC HIỆU CỦA ENZYME Enzyme có bản chất là protein nên sự xúc tác của enzyme có tính ñặc hiệu rất rõ rệt. Tính ñặc hiệu của enzyme là sự tác ñộng riêng, tác ñộng chọn lọc của từng enzyme ñối với một cơ chất hoặc một nhóm cơ chất nhất ñịnh và ñối với một kiểu phản ứng nhất ñịnh. Trước hết, enzyme có tính ñặc hiệu phản ứng, tức là ñặc hiệu theo kiểu phản ứng ñược xúc tác. Như vậy, một cơ chất có thể ñược chuyển hoá nhờ các enzyme có tác dụng ñặc hiệu khác nhau thành những sản phẩm khác nhau. Chẳng hạn một acid amin có thể ñược chuyển hoá theo kiểu phản ứng khử nhóm amin, chuyển nhóm amin hay khử nhóm carboxyl là nhờ xúc tác của các enzyme ñặc hiệu tương ứng là oxidase, transaminase hay decarboxylase. Ngoài tính ñặc hiệu theo kiểu phản ứng, enzyme còn có tính ñặc hiệu cơ chất. Một số enzyme có tính ñặc hiệu cơ chất một cách tuyệt ñối, nghĩa là chỉ xúc tác cho một cơ chất duy nhất. Ví dụ: urease chỉ xúc tác cho sự phân giải urê thành NH3 và CO2. Thường gặp hơn là ñặc hiệu tương ñối (theo nhóm), khi enzyme xúc tác một phản ứng nhất ñịnh cho cả nhóm cơ chất cùng loại (tất nhiên là với tốc ñộ khác nhau). Ví dụ: alcohol dehydrogenase xúc tác sự ôxy hoá của nhiều rượu, hexokinase xúc tác việc chuyển nhóm phosphoryl từ ATP tới các hexose khác nhau. Có những enzyme tác dụng ñặc hiệu với hai cơ chất có cấu trúc hoàn toàn khác nhau (ñặc hiệu kép). Ví dụ aminoacyl-t.RNA-synthetase, trong quá trình tổng hợp protein vừa ñặc hiệu với acid amin, vừa ñặc hiệu với t.RNA; do ñó nó vừa làm nhiệm vụ hoạt hoá acid amin ñặc hiệu, vừa chuyển gốc acid amin ñã ñược hoạt hoá cho t.RNA ñặc hiệu ñể tạo phức hợp aa-t.RNA. Tính ñặc hiệu cơ chất do phần protein enzyme quyết ñịnh. Còn tính ñặc hiệu phản ứng ở các enzyme phức tạp là do cả phần protein enzyme và cofactor quyết ñịnh. Trong nhiều trường hợp, một cofacor có thể tham gia các phản ứng khác nhau tuỳ thuộc nó ñược gắn vào protein nào. Ví dụ: pyridoxal phosphate trong các transaminase có thể tham gia phản ứng chuyển amin, trong các decarboxylase tham gia phản ứng khử carboxyl và trong các racemase tham gia phản ứng ñồng phân hoá của acid amin. Nhờ tính xúc tác ñặc hiệu của enzyme mà hệ thống phản ứng hoá sinh trong cơ thể xảy ra theo một trật tự nhất ñịnh, không hỗn loạn, tuỳ từng lúc, từng ñiều kiện mà diễn ra hoặc là phân giải, hoặc là tổng hợp. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 57 3.4. CƠ CHẾ HOẠT ðỘNG CỦA ENZYME Có sự giống nhau nào giữa xúc tác hoá học và xúc tác enzyme hay không? Có thể dùng những hiểu biết về các chất xúc tác hoá học thông thường ñể giải thích cơ chế xúc tác của enzyme hay không? Có hai dạng xúc tác hoá học là xúc tác ñồng thể và xúc tác dị thể. Trong xúc tác ñồng thể, chất xúc tác cùng pha với cơ chất (trong dung dịch). Ở trường hợp dị thể, chất xúc tác là bề mặt của pha rắn. Xúc tác enzyme nằm giữa hai thái cực này, có tính chất của cả hai, mặc dù xúc tác enzyme gần với xúc tác dị thể hơn. Tuy vậy, xúc tác enzyme có mấy ñiểm khác rất quan trọng so với các chất xúc tác thông thường, ñó là hiệu quả và tính ñặc hiệu xúc tác rất cao. Các phản ứng hoá học thường cần năng lượng hoạt hoá mới có thể xảy ra ñược. Vậy trong phản ứng enzyme, năng lượng hoạt hoá ñược lấy từ ñâu? Bởi vì phản ứng diễn ra trong TTHð, nơi các chất phản ứng bị ràng buộc chặt, năng lượng hoạt hoá không thể là năng lượng sinh ra do sự vận ñộng của cơ chất. Như vậy, năng lượng hoạt hoá phải bắt nguồn từ enzyme. Cũng giống như trong xúc tác dị thể, phân tử cơ chất ñã ñược hấp phụ có thể trao ñổi năng lượng với pha rắn; các phân tử cơ chất liên kết với enzyme có thể trao ñổi năng lượng với các cấu trúc kề cận của enzyme. Phân tử enzyme ñóng vai trò là chất dự trữ và chuyển tải năng lượng. Năng lượng có thể dễ dàng chuyển tới các nhóm xúc tác và tới cả những phần cơ chất gắn với enzyme. Năng lượng giải phóng khi cơ chất gắn với enzyme từ lâu ñược cho là nguồn năng lượng hoạt hoá của phản ứng enzyme. Chỉ một phần nhỏ phân tử enzyme trực tiếp tham gia xúc tác, phần còn lại có vai trò tạo cấu trúc ba chiều thích hợp ñể tăng cường năng lượng liên kết giữa enzyme và cơ chất. Trong quá trình xúc tác, enzyme (E) kết hợp với cơ chất – substrate (S) ñể tạo thành phức hợp trung gian enzyme-cơ chất (ES). E + S ↔ ES Hình 3-11. Tiến trình phản ứng enzyme và sự biến ñổi năng lượng tự do ∆G1: Năng lượng hoạt hoá của phản ứng không ñược xúc tác ∆G2: Năng lượng hoạt hoá của phản ứng có enzyme xúc tác Quá trình tạo phức hợp ES xảy ra rất nhanh và phức hợp này kém bền vững. Sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất xảy ra theo nhiều kiểu khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 58 cơ chất và cấu trúc phân tử enzyme. Cơ chất có cấu trúc ñặc hiệu mới có tác dụng gây cảm ứng và kết hợp ñược với TTHð của enzyme trong quá trình tiếp xúc ñể tạo phức hợp ES. Nhờ tương tác với enzyme, phân tử cơ chất bị biến ñổi theo chiều hướng hoạt ñộng hơn. Cấu tạo ñiện tử của cơ chất bị biến ñổi, các liên kết chịu tác dụng của enzyme bị căng ra, bị xoắn vặn, ñộ bền vững của liên kết bị giảm ñi, cơ chất ở vào trạng thái chuyển tiếp nhất thời, hoạt tính hoá học của nó tăng lên rất nhiều, do ñó chỉ cần năng lượng hoạt hoá rất nhỏ cũng làm cho phản ứng xảy ra nhanh chóng. Sự tạo thành phức hợp ES ñặc hiệu trong hoạt ñộng xúc tác của enzyme có những ñặc ñiểm khác với hầu hết các chất xúc tác không phải là enzyme. Phức hợp trung gian tạo thành là nhờ những liên kết yếu (hydro, ion, lực Van der Walls, kỵ nước, …). Những phản ứng tương tác xảy ra trong phức hợp ES ñều kèm theo sự giải phóng một phần năng lượng tự do. ðây là nguồn năng lượng chính ñể ñưa cơ chất vào trạng thái chuyển tiếp tạm thời và do ñó làm hạ thấp ñược năng lượng hoạt hoá của phản ứng enzyme. Sự biến ñổi các mức năng lượng trong phản ứng xúc tác của enzyme cho thấy rằng: trước hết cơ chất phải ñược hoạt hoá chuyển vào trạng thái chuyển tiếp tạm thời, phản ứng tương tác với cơ chất, tạo nên phức hợp ES. Sau ñó phức hợp ES lại ñược hoạt hoá, ñưa vào trạng thái chuyển tiếp tạm thời ñể biến thành phức hợp EP. Ở bước tiếp theo, phức hợp EP chuyển vào trạng thái chuyển tiếp tạm thời rồi tách ra thành sản phẩm P và giải phóng enzyme. Quá trình này ñược mô tả trong hình 3-11. Có thể nói, những yếu tố làm cho enzyme có hiệu quả xúc tác và tính ñặc hiệu cao là: - Bộ máy hoá học của TTHð có thể làm biến dạng hay phân cực các liên kết của cơ chất làm cơ chất trở nên hoạt ñộng hơn. - Trung tâm liên kết làm tăng nồng ñộ cơ chất và cố ñịnh cơ chất trong một không gian hình học chính xác với các nhóm xúc tác. - Sự ñịnh hướng chính xác của cơ chất trong TTHð làm cho từng bước của phản ứng diễn ra với sự dịch chuyển nhỏ nhất của cơ chất. - Phương thức cố ñịnh cơ chất ở trung tâm liên kết cung cấp năng lượng cho phản ứng enzyme. Các yếu tố trên thể hiện ở những mức ñộ khác nhau và cùng tác ñộng, làm cho enzyme có hiệu quả xúc tác và tính ñặc hiệu cao. Về bản chất hoá học của xúc tác enzyme, có một số ñiểm chính ñáng chú ý: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 59 - Các nhóm xúc tác trong TTHð trước hết là các nhóm ái nhân, tức là nhóm có các cặp ñiện tử tự do, có khả năng tạo liên kết với các nhóm ái ñiện tử của cơ chất, ví dụ: OH của serine, SH của cysteine, N trong vòng imidazol của histidine. - Trong một số trường hợp thì ngược lại, các nhóm xúc tác của enzyme lại có thể nhận ñiện tử, mà chất cho ñiện tử là các nhóm ái nhân của cơ chất. Những nhóm xúc tác ái ñiện tử này có thể là ion kim loại và nhóm NH3+ trong TTHð của một số enzyme. - Nhiều enzyme làm việc theo nguyên tắc xúc tác acid-base, nghĩa là hoạt tính của một trong các chất phản ứng tăng lên khi nhận proton hay khi bị tách mất proton. Các nhóm có tính acid hay tính base trong TTHð có hoạt tính xúc tác này, ví dụ nhóm carboxyl, amin, phenol, thiol và ñặc biệt là vòng imidazol. Các nhóm này hoạt ñộng ñồng thời như chất cho hay chất nhận proton trong ñiều kiện pH sinh lý. - Nhiều phản ứng enzyme diễn ra nhờ các cofactor. Khi gắn với enzyme, cơ chất tiếp xúc trực tiếp với cofactor, tạo ñiều kiện thuận lợi cho phản ứng xảy ra. ðồng thời các cofactor cũng thường xuyên cung cấp năng lượng cho các phản ứng enzyme (ñối với cofactor có mạch phosphate cao năng hay các nucleotide). - Rất nhiều enzyme làm tăng tốc ñộ phản ứng nhờ tạo sản phẩm trung gian rất hoạt ñộng với cơ chất. Sau ñó phản ứng phân thành hai hay nhiều phần nhỏ, và như vậy cả năng lượng hoạt hoá cũng chia thành những phần nhỏ hơn. 3.5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME Tốc ñộ các phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào: nồng ñộ cơ chất và nồng ñộ enzyme, tính chất lý hoá của môi trường và các chất gây hiệu ứng. 3.5.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất và enzyme. ðộng học của phản ứng enzyme Tốc ñộ của phản ứng enzyme thường ñược xác ñịnh qua sự biến ñổi nồng ñộ cơ chất hoặc nồng ñộ sản phẩm của phản ứng, hoặc nồng ñộ coenzyme trong một khoảng thời gian với những ñiều kiện nhất ñịnh. Brown (1902), Michaelis và Menten (1913) là những người ñầu tiên nghiên cứu về ñộng học của các phản ứng enzyme. Họ ñã theo dõi vận tốc phản ứng thuỷ phân ñường sucrose dưới tác dụng của enzyme sucrase ở những ñiều kiện khác nhau và thấy: Hình 3-12. Quan hệ giữa tốc ñộ phản ứng với nồng ñộ enzyme (a) và nồng ñộ cơ chất (b) - Nếu nồng ñộ cơ chất [S] không ñổi, thay ñổi nồng ñộ enzyme [E] thì tốc ñộ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng ñộ enzyme. ðồ thị biểu diễn quan hệ này là một ñường thẳng (a). - Ngược lại, khi [E] không ñổi, thay ñổi [S] thì tốc ñộ phản ứng phụ thuộc vào [S] theo ñường hyperbol (b). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 60 ðể ñơn giản hoá việc giải thích sự liên quan giữa tốc ñộ phản ứng enzyme và nồng ñộ cơ chất, Michaelis-Menten ñưa ra phương trình thực nghiệm với giả thuyết là phản ứng chỉ có một cơ chất và một sản phẩm ñược tạo thành. Nồng ñộ enzyme không ñổi, nồng ñộ phân tử của cơ chất lớn hơn nồng ñộ phân tử của enzyme rất nhiều. Khi cơ chất (S) gắn với TTHð của enzyme (E) sẽ hình thành phức hợp trung gian enzyme-cơ chất (ES), sau ñó enzyme ñược giải phóng và tạo ra sản phẩm (P). Quá trình của phản ứng có thể ñược khái quát như sau : Trong ñó: k1 là hằng số vận tốc hình thành phức hợp trung gian ES; k2 là hằng số vận tốc phân ly ES và k3 là hằng số tốc ñộ hình thành sản phẩm P. Hằng số k2 nhỏ hơn rất nhiều so với k3, nên tốc ñộ hình thành phức hợp ES gần bằng tốc ñộ phân giải ES thành sản phẩm và giải phóng enzyme. Tốc ñộ hình thành ES = k1.[E].[S] và tốc ñộ phân ly ES = k2.[ES] +k3.[ES] = (k2 + k3).[ES]. (1) Ở trạng thái cân bằng phản ứng thì k1.[E].[S] = (k2 + k3).[ES] Nồng ñộ enzyme tự do [E] và nồng ñộ enzyme trong hợp chất trung gian [ES] thay ñổi, song tổng của chúng luôn bằng nồng ñộ ban ñầu [Eo], nên (2) [E] = [Eo] - [ES] Thay (2) vào (1) và qua một vài biến ñổi toán học ta có: k1[Eo][S] [ES] = k2 + k3+k1[S] V0 = k3 [ES], còn Vmax = k3[Eo]. Do ñó: Trong phương trình (3), nếu Km = [S] thì V0 = Vmax/2 Phương trình (3) ñược gọi là phương trình Michaelis-Menten. Hằng số Km ñược gọi là hằng số Michaelis-Menten, là hằng số tổng hợp của các hằng số tốc ñộ. Km chính là nồng ñộ cơ chất mà ở ñó vận tốc phản ứng ñạt một nửa tốc ñộ tối ña. Km chia ñồ thị ra làm hai vùng: - Ở nồng ñộ cơ chất thấp, thấp hơn nhiều so với Km thì v ≈ Vmax.[S]/Km ≈ k. [S] tức là vận tốc phản ứng tỷ lệ với [S]. - Khi nồng ñộ cơ chất cao hơn nhiều so với Km thì v ≈ Vmax.[S]/[S] ≈ Vmax Khi nồng ñộ cơ chất cao, vận tốc phản ứng tiến dần ñến tốc ñộ tới hạn. Khác với Vmax, Km không phụ thuộc vào nồng ñộ enzyme mà phụ thuộc vào môi trường (pH, nhiệt ñộ, các chất gây hiệu ứng, …), cho nên sau số liệu Km cần thiết phải bổ sung ñiều kiện mà ở ñó Km ñã ñược xác lập. Hằng số Km ñặc trưng cho khả năng xúc tác của một enzyme ñối với một cơ chất nhất ñịnh. ðối với ña số enzyme, Km dao ñộng trong khoảng 10-1 – 10-6 mol.dm-3. Km càng thấp thì ái lực của enzyme với cơ chất càng cao. Khi biết ñược Km có thể ước ñoán nồng ñộ cơ chất khi phản ứng ñạt tốc ñộ tối ña, tính toán ñược vận tốc ban ñầu của phản ứng ở nồng ñộ cơ chất nhất ñịnh, hay ngược lại có thể tính nồng ñộ cơ chất cần thiêt ñể phản ứng ñạt một vận tốc nào ñó. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 61 Phương trình Michaelis- Menten còn cho thấy mối quan hệ giữa Vmax (tốc ñộ tới hạn) và hằng số vận tốc k3. Khi bão hoà cơ chất, vận tốc phản ứng ñạt cực ñại (Vmax): v = Vmax = k3.[Eo] Nếu biết nồng ñộ Eo và từ giá trị vận tốc Vmax ño ñược, có thể tính ñược hằng số k3. Hằng số này sẽ cho biết hoạt tính phân tử của enzyme (số phân tử hay số mol cơ chất ñược 1 mol enzyme biến ñổi trong thời gian 1 giây ở ñiều kiện tối ưu). Nồng ñộ cơ chất là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới hoạt ñộng xúc tác của enzyme. Trong các phản ứng enzyme, khi nhiệt ñộ, pH, … ổn ñịnh thì tốc ñộ phản ứng phụ thuộc nồng ñộ enzyme và cơ chất của nó. Nếu nồng ñộ enzyme không ñổi, khi nồng ñộ cơ chất tăng thì tốc ñộ phản ứng sẽ tăng dần ñến tốc ñộ cực ñại (Vmax) và ñồ thị có dạng hyperbol, như trong hình 312 (b). ðồ thị cho thấy tốc ñộ phản ứng không tăng theo ñường thẳng khi nồng ñộ cơ chất tăng dần. Ở những nồng ñộ cơ chất cao, tốc ñộ phản ứng tiến gần ñến tốc ñộ tới hạn (Vmax), nguyên nhân là tất cả enzyme sắp bão hoà cơ chất. Nói cách khác, khi tất cả các TTHð của enzyme ñã kết hợp với cơ chất thì dù có tăng nồng ñộ cơ chất lên bao nhiêu, tốc ñộ phản ứng cũng không tăng lên ñược nữa. Vmax và Km là hai hằng số cơ bản của mỗi enzyme mà các nghiên cứu cơ bản về enzyme ñều phải xác ñịnh. Vmax ñược xác ñịnh trên ñồ thị Michaelis-Menten là dựa trên một ñường tiếp tuyến với ñồ thị và Km ñược xác ñịnh từ một ñiểm trên trục hoành tương ứng với ñiểm1/2Vmax. Vì vậy, những trị số tìm ñược không chính xác. Thông thường, phương trình Michaelis-Menten ñược nghịch ñảo. Dạng nghịch ñảo này ñược gọi là phương trình Lineweaver-Burk : ðây là nền tảng ñể dựng ñồ thị Lineweaver-Burk, cho phép tìm Km và Vmax dễ dàng và chính xác. Hình 3-13. ðồ thị Lineweaver-Burk ðộng học của các phản ứng nhiều cơ chất: Thường thì enzyme xúc tác cho phản ứng của 2 cơ chất và tạo ra 2 sản phẩm. Cơ chế diễn ra hơi khác so với phản ứng một cơ chất. Trước hết E kết hợp với một cơ chất (A), tao phức hơp EA. Nhờ sự thích hợp cảm ứng tạo ra sự thay ñổi cấu hình của tổ hợp, nên EA→(EA)+, tạo ñiều kiện ñể phân tử B ñược gắn vào, (ñối với enzyme tự do thì B có ái lực thấp), hình thành tổ hợp EAB. Sau khi phản ứng tiếp tục xảy ra, tức là tổ hợp EAB biến thành EPQ (trong ñó P và Q là những sản phẩm), thì P rồi Q lần lượt sẽ ñược tách ra. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 62 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ Nhiệt ñộ là một trong các yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng ñến hoạt tính của enzyme. Bình thường, tốc ñộ của phản ứng tăng khi nhiệt ñộ tăng. Chừng nào enzyme chưa bị biến tính, mỗi khi tăng 10°C, tốc ñộ phản ứng sẽ tăng 10 lần. Tuy nhiên, khi nhiệt ñộ tăng ñồng thời cũng làm enzyme mất hoạt tính (vì apoenzyme biến tính và cofactor có thể bị tách ra). Khi tăng nhiệt ñộ lên khoảng 60-70°C, phần lớn enzyme mất hẳn hoạt tính và nhiệt ñộ này ñược gọi là nhiệt ñộ tới hạn. Chính vì hai hiện tượng trái ngược trên mà mỗi enzyme có một nhiệt ñộ thích hợp (tối ưu) cho hoạt ñộng xúc tác; ở nhiệt ñộ ñó phản ứng diễn ra nhanh nhất. Hình 3-14. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính xúc tác của enzyme Các enzyme của ñộng vật máu nóng hoạt ñộng tốt nhất xung quanh thân nhiệt. Ở các vi sinh vật chịu nhiệt, enzyme của chúng có nhiệt ñộ thích hợp cao. Ở các vi sinh vật cảm ứng, sống trong các suối nước nóng, nhiệt ñộ thích hợp có thể lên ñến 90°C. Nhiều enzyme thực vật cũng có nhiệt ñộ thích hợp rất cao; chẳng hạn, papain hoạt ñộng mạnh nhất ở 80°C. Nhiệt ñộ thích hợp của một số enzyme không cố ñịnh, mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố (thời gian tác dụng, nồng ñộ enzyme, nồng ñộ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme). Ở nhiệt ñộ thấp, hoạt ñộ xúc tác của enzyme giảm. Hoạt ñộ của nhiều enzyme còn không ñáng kể ở 0°C. Khi tăng nhiệt ñộ lên, hoạt tính enzyme lại tăng theo. 3.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường Các enzyme thường rất nhạy cảm với pH của môi trường, nên pH có ảnh hưởng rất nhiều ñến hoạt tính xúc tác của chúng. Hoạt tính xúc tác của enzyme phụ thuộc vào pH là do các nhóm chức có thể bị phân ly cho H+ ở TTHð của enzyme hay của cơ chất qui ñịnh; phản ứng của enzyme và cơ chất phụ thuộc khả năng tách proton của các nhóm chức này. (a) (b) Hình 3-15. pH tối ưu của pepsin (a) và chymotrypsin (b) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 63 Do ñó, phần lớn các enzyme chỉ có khả năng xúc tác ở một khoảng pH nhất ñịnh, ngoài khoảng này, tốc ñộ xúc tác sẽ giảm. Enzyme ñạt tốc ñộ xúc tác cực ñại ở pH tối ưu. ða số các enzyme có pH tối ưu khoảng 5-7. Một số enzyme tiêu hoá lại hoạt ñộng tốt nhất ngoài khoảng này; ví dụ, pepsin hoạt ñộng tốt nhất khi pH vào khoảng 1,5-2, trypsin và chymotrypsin có pH tối ưu khoảng 8-11. Ở một số enzyme, khoảng pH tối ưu khá hẹp, ở một số khác lại khá rộng. ðôi khi pH tối ưu có thể khác và phụ thuộc vào loại cơ chất, ví dụ pH tối ưu ở các enzyme phân giải protein có thể thay ñổi phụ thuộc vào loại protein ñược phân giải. 3.5.4. Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá và chất ức chế Hiệu quả xúc tác của enzyme bị ảnh hưởng bởi nhiều chất. Những chất ảnh hưởng ñến hiệu quả xúc tác của enzyme ñược gọi là các chất gây hiệu ứng (effector). Chất gây hiệu ứng làm tăng hoạt tính enzyme ñược gọi là chất hoạt hoá, chất làm giảm tác dụng của enzyme ñược gọi là chất ức chế. Chất gây hiệu ứng nội sinh có thể là các sản phẩm trao ñổi chất, các coenzyme; ñây là các chất ñóng vai trò quan trọng trong ñiều hoà trao ñổi chất của tế bào. Các chất gây hiệu ứng ngoại sinh có thể là các loại thuốc, các chất ñộc có tác dụng ức chế enzyme. ðể có thể hoạt ñộng, nhiều enzyme cần các chất hoạt hoá (có thể là ion kim loại, các chất hữu cơ hay ñôi khi là các anion như Cl-, -PO32-). Các chất hoạt hoá thường không gắn cố ñịnh với enzyme (không phải là thành phần của enzyme hay là các nhóm ghép cố ñịnh). Các chất ức chế là những chất kìm hãm phản ứng enzyme, có bản chất khác nhau (ion, các chất vô cơ hay hữu cơ). Chúng làm thay ñổi cấu trúc phân tử enzyme làm enzyme mất khả năng xúc tác, hay cạnh tranh với cơ chất về TTHð làm giảm tốc ñộ phản ứng, hoặc là không làm enzyme bị biến tính nhưng làm cho phức hợp ES không thể tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme. Hiện tượng ức chế enzyme không những là công cụ ñiều hoà của tế bào mà còn có rất nhiều ý nghĩa thực tiễn: y học, thú y (chống nhiễm trùng), trong nông nghiệp (sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng) và cả trong chiến tranh (các vũ khí hoá học). Hình 3-16. Chất ức chế cạnh tranh gắn vào TTHð (a); chất ức chế không cạnh tranh gắn gắn vào vị trí khác, song chỉ gắn với phức hợp ES (b) Ức chế enzyme là hiện tượng rất phổ biến trong ñời sống sinh vật. Trên 90% các hiện tượng trúng ñộc là do sự ức chế hoạt ñộng của các enzyme. Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự phong bế TTHð của các enzyme. Ví dụ: Các enzyme hô hấp (cytochrome) trong chuỗi hô hấp mô bào có nhóm ghép là nhóm hem với nguyên tử sắt có thể biến ñổi hoá trị khá linh ñộng, thường xuyên cho và nhận các ñiện tử trong quá trình vận chuyển ñiện tử. Khi ngộ ñộc HCN (cyanic acid) thì xảy ra phản Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 64 ứng kết hợp gốc CN- với nguyên tử sắt ba tạo ra phức hợp bền vững (Fe+3-CN). Do ñó, khả năng trao ñổi ñiện tử của hệ thống cytochrome bị trở ngại, gây hiện tượng ngạt từ các mô bào. Có thể phân loại các chất ức chế theo nhiều cách. Theo nguồn gốc, chúng ñược phân thành: chất ức chế tự nhiên và chất ức chế nhân tạo. Theo tác dụng ñặc hiệu chúng ñược phân thành: chất ức chế ñặc hiệu (ức chế một hay một số enzyme giống nhau) và chất ức chế không ñặc hiệu (ức chế nhiều enzyme, ví dụ các chất gây biến tính enzyme). Theo cơ chế tác ñộng, các chất ức chế ñược chia thành: chất ức chế cạnh tranh và chất ức chế không cạnh tranh. Chất ức chế cạnh tranh: không ảnh hưởng tới Vmax, nhưng làm tăng Km. Các chất ức chế cạnh tranh có cấu trúc (cả phân tử hay phần làm nhiệm vụ liên kết với enzyme) giống cơ chất, làm enzyme không nhận cơ chất, thay cho tạo phức hợp ES lại tạo phức hợp enzyme chất ức chế (EI) không chuyển thành sản phẩm ñược; như vậy, enzyme bị phong bế. Phức hợp EI có thể có thể phân ly thuận nghịch thành E và I (chất ức chế). Nếu có cơ chất, thì cơ chất S và chất ức chế I sẽ cạnh tranh nhau về TTHð. Mức ñộ ức chế sẽ phụ thuộc vào tỷ lệ nồng ñộ 2 chất và ái lực của chúng với enzyme. Tác dụng ức chế có thể hoàn toàn bị loại bỏ khi nồng ñộ cơ chất ñược nâng cao. Chất ức chế cạnh tranh còn có thể cạnh tranh với các coenzyme về trung tâm liên kết trên bề mặt phân tử enzyme. Chất ức chế không cạnh tranh: không làm ảnh hưởng tới sự liên kết của enzyme với cơ chất, nhưng làm giảm tốc ñộ tạo ra sản phẩm. Các chất ức chế này không ảnh hưởng tới hằng số Km, nhưng làm giảm tốc ñộ tối ña của phản ứng. Tác dụng ức chế không phụ thuộc vào nồng ñộ cơ chất nên không thể loại bỏ bằng cách tăng nồng ñộ cơ chất. Các chất ức chế không cạnh tranh tác ñộng theo cơ chế gây hiệu ứng dị không gian (allosteric effect). 3.6 . CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI ENZYME Thời kỳ ñầu, khi enzyme học chưa phát triển, nhiều cơ chế hoá sinh còn chưa sáng tỏ, người ta thường gọi các enzyme ñược phát hiện bằng những tên riêng khác nhau, và tên enzyme thường có ñuôi "in". Cho ñến nay một số vẫn ñược dùng; ví dụ: pepsin, trypsin, vv… Sau ñó, các enzyme thường ñược ñặt tên bằng cách thêm ñuôi "ase" vào tên cơ chất hay kiểu phản ứng; ví dụ: urease xúc tác sự thuỷ phân urê, DNA-polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA. Số lượng enzyme tìm ra ngày càng nhiều, ñòi hỏi phải ñược phân loại và gọi tên một cách thống nhất. Bên cạnh tên gọi thông thường, tiểu ban enzyme (EC) của Hội hoá sinh quốc tế (IUB) ñã thống nhất ñưa ra một hệ thống cho tên gọi và phân loại enzyme vào năm 1961. Tên gọi và phân loại thống nhất ñã ñược xem xét, cân nhắc lại và bổ sung vào những năm 1964, 1972, 1978 và 1984. Theo cách phân loại này, các enzyme ñược chia thành 6 lớp theo kiểu phảnn ứng mà enzyme xúc tác và ñựợc ñánh số từ 1 ñến 6. Mỗi lớp lại ñược chia thành các tổ, mỗi tổ lại chia thành các nhóm. Tên enzyme gồm ba phần: phần thứ nhất là tên cơ chất ñặc hiệu (nếu phản ứng có hai cơ chất tham gia thì lấy tên cả hai), phần thứ hai là tên kiểu phản ứng, phần thứ ba là ñuôi ase. Như vậy, enzyme xúc tác cho cơ chất A nhờ dạng phản ứng R có tên là Arase; enzyme xúc tác phản ứng của chất A với chất B (hay cofactor B) nhờ phản ứng dạng R, có tên A:B-Rase. Ví dụ: tên hệ thống của enzyme xúc tác cho phản ứng ATP + Glucose → ADP + Glucose-6-phosphate là ATP:glucose phosphotransferase, chuyển nhóm phosphoryl từ ATP tới glucose. Mỗi enzyme ñược ký hiệu bằng 4 chữ số: chữ số thứ nhất chỉ lớp, chữ số thứ hai chỉ tổ, chữ số thứ ba chỉ nhóm và chữ số thứ tư là của từng enzyme. Enzyme xúc tác cho phản ứng nêu trên có ký hiệu là EC. 2.7.1.1 là enzyme thuộc lớp 2, tổ 7, nhóm 1 và có số thứ tự là 1. Trong thực tiễn, tên thông thường thường ñược sử dụng nhiều hơn. Enzyme có ký hiệu nêu trên ñược gọi là hexokinase. Tên hệ thống chỉ hay ñược dùng khi giới thiệu enzyme. Hệ thống phân loại quốc tế chia enzyme thành 6 lớp theo kiểu phản ứng, bao gồm: Lớp 1: Oxidoreductase Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 65 Lớp này xúc tác cho các phản ứng ôxy hoá khử, là một trong những lớp lớn nhất, có bản chất là các protein phức tạp. Các enzyme thông thường ñã biết như dehydrogenase, oxidase, cytochromereductase và peroxidase thuộc lớp 1. Trong các phản ứng do chúng xúc tác xảy ra sự vận chuyển hydro, vận chuyển ñiện tử, sự ôxy hoá bởi ôxy phân tử, bởi hydrogen peroxide hoặc bởi các chất ôxy hoá khác. Lớp 2: Transferase Các transferase thực hiện sự vận chuyển nhóm (ví dụ -CH3, -NH2, vv…) từ một cơ chất tới một chất nhận. Chẳng hạn transaminase chuyển nhóm -NH2 từ một acid amin tới một ketoacid. ðây là một lớp lớn, có bản chất là các protein phức tạp, tham gia vào nhiều quá trình hoá học, ñược phân thành các phân lớp theo các nhóm ñược vận chuyển. Lớp3: Hydrolase Enzyme lớp này thực hiện sự thuỷ phân các liên kết hoá học (vốn hình thành nhờ các quá trình ngưng tụ như peptide, glycoside, ester …). ðây cũng là một lớp lớn, song hầu hết có bản chất là các protein ñơn giản. Lớp 4: Liase ðây là các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước. Thuộc lớp này có aldolase, decarboxylase, một số desaminase, ... Chúng tách từ cơ chất hay mang tới cơ chất các phân tử nhỏ (như H2O, CO2, NH3, vv…) mà không cần các chất khác tham gia. Lớp này có bản chất là các protein phức tạp, là lớp không lớn, trước ñây ñược gọi là synthase. Lớp 5: Isomerase Enzyme lớp này vận chuyển các nguyên tử hay nhóm nguyên tử trong nội bộ một phân tử, tạo ra chất ñồng phân. Các kiểu phản ứng do các enzyme lớp này xúc tác có thể là: racemic hoá, ñồng phân hoá (cis ↔ trans), (aldehyde ↔ keto). ðây là lớp enzyme nhỏ nhất, phần lớn có bản chất là các protein ñơn giản. Lớp 6: Ligase (Synthetase) Các ligase xúc tác cho các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất phức tạp từ các chất ñơn giản nhờ năng lượng từ ATP hoặc các hợp chất cao năng khác. Enzyme lớp này có bản chất là các protein phức tạp, còn ñược gọi là synthetase. Câu hỏi ôn tập: 1. Nêu ñịnh nghĩa và bản chất hoá học của enzyme ? 2. Cấu tạo và cơ chế hoạt ñộng của các cofactor: NAD+, NADP+, FMN, FAD ? 3. Trung tâm hoạt ñộng của enzyme: khái niệm, cấu tạo ? 4. Enzyme dị lập thể: cấu tạo, chức năng ? 5. Các zimogen và isozyme là gì ? 6. Tính ñặc hiệu của enzyme: ñịnh nghĩa, nguyên nhân, ý nghĩa? 7. Sơ lược về cơ chế hoạt ñộng của enzyme ? 8. Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme và nồng ñộ cơ chất tới hoạt tính xúc tác của enzyme ? 9. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới hoạt tính xúc tác của enzyme ? 10. Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá và ức chế ñến hoạt tính xúc tác của enzyme ? 11. Tên gọi và phân loại enzyme theo kiểu phản ứng ? Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 66 Tài liệu tham khảo: 1. Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hoàng Bích Ngọc, Vũ Thị Phương, (2001). Hoá sinh, Nxb Y học, Hà Nội. 2. Ngô Xuân Mạnh, Vũ Kim Bảng, Nguyễn ðặng Hùng, Vũ Thy Thư (2006). Hoá sinh thực vật. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer (2002). Biochemistry. Fifth Edition. Freeman and Company. New York. 4. Nelson D. L., Cox M. M. (2005). Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition. Freeman and Company, New York, USA. 5. Zdenek Vodrazka (1996). Biochemie; Academia, Praha. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… …… 67 Chương 4 NUCLEIC ACID Tóm tắt: Nucleic acid gồm Deoxyribonucleic acid (DNA) cấu tạo từ 2 mạch polynucleotide và các Ribonucleic acid (RNA) cấu tạo từ một mạch polynucleotide. Các mạch polynucleotide cấu tạo từ các mắt xích mononucleotide. DNA cấu tạo từ 4 mắt xích là dAMP, dGMP, dCMP và TMP; RNA cấu tạo từ 4 mắt xích là AMP, GMP, CMP và UMP. DNA có cấu trúc chuỗi xoắn kép. Các RNA có cấu trúc không gian ổn ñịnh ñặc thù ñể thực hiện các chức năng sinh học. DNA thực hiện việc bảo tồn thông tin di truyền nhờ quá trình tái bản (DNA Replication – sinh tổng hợp DNA) và thể hiện thông tin di truyền thông qua quá trình phiên mã (RNA Transcription – sinh tổng hợp các RNA) và dịch mã (Translation sinh tổng hợp proein). Trong quá trình phân giải DNA và RNA dưới tác dụng của enzyme Deoxiribonuclease và Ribonuclease bị thủy phân thành các mắt xích mononucleotide; các mononucleotide sẽ bị nucleotidase thủy phân giải phóng ra phosphoric acid và nucleoside; các nucleoside bị nucleosidase thủy phân thành ñường pentose và các base nitơ. Các base purin bị oxy hóa dần dần thành các sản phẩm cuối cùng là uric acid hoặc allantoin; Các base pyrimidin bị oxy hóa dần dần thành các sản phẩm cuối cùng là ure và ammoniac. Nucleic acid là những hợp chất cao phân tử phức tạp ñóng vai trò quan trọng nhất trong hoạt ñộng sống của các cơ thể sinh vật và ñược hình thành nên từ các mắt xích mononucleotide. Nucleic acid ñược nhà bác học Thụy Sỹ F.Miescher phát hiện lần ñầu tiên vào năm 1868 trong tinh trùng của cá hồi, sau ñó năm 1869 từ nhân của bạch cầu. Tuy vậy, chỉ từ những năm 50 của thế kỷ XX trở lại ñây, khi các phương pháp hoá học và vật lý ñược sử dụng rộng rãi, thì các vấn ñề về cấu tạo hoá học, các tính chất hoá - lý và vai trò sinh học của nucleic acid mới ñược nghiên cứu và làm sáng tỏ. Trong cơ thể sinh vật, nucleic acid có nhiều nhất ở các mô, cơ quan giầu nhân và có quá trình tổng hợp protein xảy ra mạnh mẽ như ở thực vật là các lá non, các ñỉnh sinh trưởng, chồi, phôi hạt, phấn, ñỉnh, rễ…; ở ñộng vật và người: ở tinh trùng, gan, tim. Nucleic acid ñóng vai trò quan trọng trong việc bảo tồn và truyền thông tin di truyền, trong việc thực hiện chức năng coenzyme trong các phản ứng trao ñổi chất và trao ñổi năng lượng. 4.1. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA NUCLEIC ACID Nucleic acid (polynucleotide) khi thuỷ phân sẽ cho ta các mononucleotide (Hình 4.1). Sau ñó mononucleotide bị phân giải thành base chứa nitơ (base purine hay pyrimidine), ñường pentose và phosphoric acid. Như vậy là các base chứa nitơ, ñường pentose và phosphoric acid là thành phần hoá học cơ bản cấu tạo nên các polynucleotide (các nucleic acid). 4.1.1. Các base chứa nitơ Trong thành phần của nucleic acid có 2 loại base nitơ: base purine và base pirimidine. Các base purine (dẫn xuất của hợp chất dị vòng purine) quan trọng là adenine và guanine. Cả 2 base này ñều thấy có trong 2 loại nucleic acid: deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA). Các base pyrimidine của các nucleic acid là uraxil, thymine và cytosine. Trong thành phần của DNA có các base pyrimidine thymine và cytosine, còn trong các RNA có uracil và cytosine. Ngoài các base chứa nitơ chủ yếu, trong thành phần nucleic acid còn phát hiện thấy các dẫn xuất vốn ñược metthyl hoá của các base chứa nitơ purine và pyrimidine. Các dẫn xuất này ñược gọi là các base hiếm. Chúng chiếm từ 0,1 ñến 1% trong tổng số Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……68 các base chứa nitơ có trong nucleic acid. ðặc biệt các base hiếm có nhiều loại (8 - 19% tổng các base chứa nitơ) trong các tRNA (RNA vận chuyển). Nucleic acid (DNA, RNA) Ribonuclease Desoxyribonuclease Mononucleotide Nucleotidase Nucleoside H3PO4 Nucleosidase Base nit¬ Base pyrimidine Base purine §−êng pentose Deoxyribose DNA Ribose RNA Hình 4.1. Sơ ñồ phân giải nucleic acid Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……69 Hình 4.2. Cấu tạo của các base nitơ Hình 4.3. Sự hỗ biễn của các base nitơ 4.1.2. ðường pentose Trong thành phần của nucleic acid có mặt ñường pentose tức là ribose hay deoxyribose dưới dạng β-D-furanose: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……70 Dựa vào thành phần của ñường pentose mà người ta chia nucleic acid thành 2 nhóm: nhóm nucleic acid chứa β - D - 2 - deoxyribose-deoxyribonucleic acid (DNA) và nhóm nucleic acid chứa β - D – ribose - ribonucleic acid(RNA). 4.1.3. Nucleoside Khi các base purine và pyrimidine kết hợp với ñường ribose hay deoxyribose sẽ tạo nên các nucleoside tương ứng. Nói một cách khác, nucleoside là N- glicoside của các base purine và pyrimidine. ðường pentose liên kết với các base purine và pyimidine bằng liên kết glycoside theo một qui luật hết sức nghiêm ngặt. Các liên kết glycoside ñược tạo thành giữa C ở vị trí số 1 của ñường pentose (ribose hay deoxyribose) và nitơ ở vị trí số 9 trong vòng purine và nitơ ở vị trí số 3 trong vòng pyrimidine của các base pyrimidine ở dạng lactam (dạng xeto). ðường ribose kết hợp với các base chứa nitơ tạo thành các nucleoside tương ứng: adenosine, guanosine, uridine và cytidine. ðường deoxyribose kết hợp với các base chứa nitơ tạo thành các nucleoside sau ñây: deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine và deoxycytidine (Hình 4.4) 4.1.4. Nucleotide Các nucleoside tạo thành este tương ứng khi kết hợp với photphoric acid. Hợp chất này ñược gọi là nucleotide. Nếu trong thành phần nucleotide có deoxyribose thì liên kết este tạo thành với photphoric acid ở vị trí cacbon 3' và 5', còn khi có ribose thì ở các vị trí 2', 3' và 5'. Trong tự nhiên còn tồn tại cả các monophosphate (3'-AMP, 5'AMP ). Tuy nhiên các nucleotide có trong tế bào ở dạng tự do thường có nhóm phosphate chủ yếu ở vị trí 5'. Các nucleotide có mặt ribose trong phân tử của chúng thì ñược gọi là ribonucleotide, còn các nucleotide có deoxyribose - deoxyrobonucleotide. Vì các nucleotide là các este photphoric của các nucleoside, cho nên tên của chúng ñược tạo nên từ tên của các nucleoside và photphoric acid. Do các nucleotide có tính axit mạnh nên chúng thường ñược gọi là các acid. Người ta gọi tên nucleotide bằng cách lấy tên nucleoside sau ñó thêm số lượng gốc phosphate tạo este và chỉ rõ vị trí nhóm OH bị este hoá. Các ribonucleotide bao gồm cytidine monophotphat (CMP) hay cytidine monophotphoric acid, hay cytidilic acid; uridine monophotphat (UMP) hay uridine monophotphoric acid, hay uridilic acid; adenosine monophotphat (AMP) hay adenosine monophotphoric acid, hay adenlic acid và guanosine monophotphat (GMP) hay guanosine monophotphoric acid hay guanilic acid. Các deoxyribonuceotide bao gồm deoxycytidine monophotphat (dCMP) hay deoxycytidine monophotphoric acid, hay deoxyxitidilic acid; deoxyadenosine monophotphat (dTMP) hay deoxythymidine Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……71 monophotphoric acid, hay deoxythimidilic acid; deoxyadenosine monophotphat (dAMP) hay deoxyadenosine monophotphoric acid, hay deoxyadenilic acid và deoxyguanosine monophotphat (dGMP) hay deoxyguanosine monophotphoric acid hay deoxyguanilic acid. Các ribonucleotide và deoxyribonucleotide ñược trình bày ở hình 4.4. Hình 4.4. Các nucleoside và nucleotide Trong cơ thể thường gặp các nucleotide khác liên kết với enzyme này hay enzyme khác vốn ñóng vai trò ñặc biệt quan trọng. Cấu tạo của các nucleotide này thường ñặc trưng bởi sự hình thành liên kết este photphoric ở vị trí C 5' của ñường pentose, ngoài ra trong nucleotide thường có 2 hoặc 3 gốc photphat. ðại diện quan trọng nhất của nhóm này là adenosine - 5' - monophotphat (AMP), adenosine -5'- diphotphat (ADP) và adenosine- 5' - triphotphat (ATP). ATP là chất mang năng lượng hoá học chủ yếu ở trong tế bào: Khi khử photphoril - hoá ATP bằng cách thuỷ phân sẽ tạo thành ADP và AMP. Quá trình khử photphoril - hoá ATP có kèm theo sự giải phóng năng lượng vốn ñược sử dụng vào quá trình tổng hợp và sinh công trong tế bào. ADP nhờ năng lượng giải phóng ra trong các quá trình oxi hoá ñược photphoril- hoá trở thành ATP. Trong các tế bào của cơ thể sống các quá trình khử photphoril- hóa ATP, photphoril - hoá ADP và AMP xảy ra thường xuyên. Tương tự như AMP cũng xảy ra sự photphoril - hoá ñối với các nucleotide khác: guanosinephotphat (GMP → GDP → GTP), Uridine photphat ( UMP → UDP → UTP), cytidinephotphat (CMP→ CDP → CTP). Tất cả các Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……72 hợp chất này ñều ñóng vai trò quan trọng trong quá trình trao ñổi chất và trao ñổi năng lượng ở trong tế bào nhất là trong quá trình tổng hợp lipide và glucide. Hình 4.5. AMP, cAMP, ADP và ATP Các nucleotide khác và các dẫn xuất của chúng cũng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình trao ñổi chất. Nicotinamid - adenine - dinucleotide (NAD+), Nicotinamid - adenine - dinucleotide - photphat (NADP+), flavin - mononucleotide (FMN), flavin – adenine dinucleotide (FAD) ñều là những chất vận chuyển hidro trung gian trong các phản ứng oxi hoá-khử. Coenzyme A (CoA) có cấu tạo theo nguyên tắc nucleotide ñóng vai trò quan trọng trong việc hoạt hoá quá trình vận chuyển và trao ñổi các axit béo và các quá trình khác. Các mononucleotide vốn ñặc trưng cho từng loại nucleic acid ñược kết hợp với nhau thành một phân tử với số lượng hàng trăm, ñôi khi hàng nghìn gốc nhằm tạo thành các mạch polynucleotide khổng lồ tức là các nucleic acid khác nhau. Theo thành phần của ñường pentose người ta phân chúng ra thành 2 nhóm: deoxiribonucleic acid (DNA) chứa deoxyribose và ribonucleic acid (RNA), chứa ribose. Ngoài ra chúng còn khác nhau về thành phần về cấu tạo của các base chứa nitơ. Trong DNA có Adenine, guanine, cytosine và Thimine, còn trong RNA có Adenine, guanine, cytosine và uraxil. 4.2. CẤU TẠO CỦA CÁC NUCLEIC ACID 4.2.1. Cấu tạo DNA Phân tử deoxiribonucleic acid (DNA) ñược tạo thành từ hai mạch polynucleotide. Mỗi mạch polynucleotide ñược hình thành từ hàng trăm, hàng nghìn gốc deoxymononucleotide (dAMP, dGMP, dCMP và dTMP). Các mononucleotide liên kết với nhau bằng liên kết dieste photphoric, liên kết dieste photphoric ñược hình thành giữa nhóm OH của gốc cacbon 3' của một mononucleotide này với gốc cacbon 5' của một mononucleotide khác. Trong phân tử DNA không phát hiện thấy hiện tượng phân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……73 nhánh. Tuy cấu tạo một phân tử DNA hoàn chỉnh chưa ñược xây dựng, nhưng có thể trình bày cấu tạo của một ñoạn mạch polynucleotide của DNA như trình bày ở hình 4.6. Trong mononucleotide - ñơn vị cấu trúc DNA - có các liên kết glicoside vốn liên kết các base chứa nitơ với các ñường pentose, liên kết este giữa ñường pentose với photphoric acid và liên kết dieste giữa các nuleotide. Tất cả các liên kết này ñều bền vững, ñồng hoá trị, chúng tạo nên cấu trúc bậc nhất của DNA tức là thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc mononucleotide trong mạch polynucleotide của DNA. Hình 4.6. Cấu tạo mạch polynucleotide của DNA và RNA Song song với các liên kết trên, trong phân tử DNA còn có các liên kết hidro, chúng ñóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc không gian của DNA. Cấu trúc không gian của DNA (cấu trúc bậc hai) ñầu tiên ñược J. Watson và F.Crick ñề xường vào năm 1953 (Mô hình chuỗi xoắn kép của DNA). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……74 4.7. Mô hình cấu tạo DNA Cơ sở tổ chức cấu trúc bậc hai của phân tử DNA là các qui luật về cấu tạo hoá học ñã ñược E.Chargaff xác lập (các qui tắc E.Chargaff ) năm 1947. Các qui tắc này ñược tóm tắt như sau: (1). Hàm lượng (ñương lượng phân tử) của các base purine trong DNA bằng hàm lượng các base pyrimidine, có nghĩa là hàm lượng adenin bằng hàm lượng thymine ( A=T, hay A/T=1) hàm lượng guanine bằng cytosine (G=C, hay G/C=1), hàm lượng tổng số của adeniê và guaniee bằng hàm lượng tổng số của cytosine và thymine: (A+G) = (C+T), A+G)/(C+T)=1. (2). Số lượng các nhóm 6-amin của các base chứa nitơ có trong DNA (guanin+thymine), bằng số lượng các nhóm 6-xeto và 4-xeto của các base nitơ trong DNA, như vậy (G+T)=(A+C) hay (G+T)/(A+C)=1. Những kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu cấu trúc bằng tia Rơngen ñã thúc ñẩy việc hình thành các quan niệm về cấu trúc bậc hai của DNA (Mô hình J.Watson và F.Crick). Quan niệm này cho rằng trong phân tử DNA cấu tạo từ 2 mạch Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……75 polynucleotide nằm song song ngược chiều nhau, xoắn lại với nhau. Mỗi mạch là một polynucleotide trong ñó các mononucleotide nối lại với nhau nhờ các liên kết dieste phosphoric. Dọc theo trục của mỗi mạch cứ 0,34 nm có 1 mononucleotide. Góc nghiêng giữa các mononucleotide cạnh nhau trong từng mạch là 360. Trong mạch các mononucleotide nằm sao cho các base nằm phía trong, còn ñường pentose và phosphoric acid nằm phía ngoài. Hai mạch polynucleotide xoắn với nhau xung quanh một trục chung và liên kết với nhau thông qua các base chứa nitơ dọc theo phân tử DNA nhờ các liên kết hidro. Các liên kết hidro hướng từ nhóm NH2 của adenin ñến nhóm OH của thymine và từ nhóm - NH2 của guamin ñến nhóm - OH của cytosine. ðiều này có nghĩa là trình tự sắp xếp các base chứa nitơ ở một trong hai mạch có thể tuỳ ý, nhưng trình tự sắp xếp các base chứa nitơ ở trong mạch thứ hai sẽ phụ thuộc một cách nghiêm ngặt vào trình tự sắp xếp các base chứa nitơ trong mạch thứ nhất. Các cặp Adenin - Thymine và Guanin - Cytosine là những cặp bổ sung . Nói tóm lại phân tử DNA ñược cấu tạo từ 2 mạch polinucletide bổ sung cho nhau, có nghĩa là trình tự sắp xếp các base chứa nitơ trong một mạch polynucleotide phản ánh một cách chính xác trình tự sắp xếp các base chứa nitơ trong mạch polynucleotide thứ hai. Hình 5.8. Cấu trúc không gian của DNA Tuỳ theo ñiều kiện của môi trường xung quanh mà phân tử DNA tồn tại ở các dạng có sự phân bố không gian khác nhau: dạng bó, dạng que bền vững, dạng sợi…ðây chính là cấu trúc bậc ba của DNA. 4.2.2. Cấu tạo của RNA Trong cơ thể sinh vật tồn tại 4 loại RNA: RNA thông tin (mRNA), RNA vận chuyển (mRNA), RNA ribosome (rRNA) và RNA nhỏ (sRNA). Khác với DNA, ñại bộ phận các loại RNA có cấu trúc một mạch (trừ RNA của một số vi sinh vật và virus). Cấu trúc bậc nhất của RNA là số lượng và trình tự sắp xếp của các mononucleotide trong mạch polynucleotide. Mạch RNA tự xoắn trong không gian tạo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……76 nên các liên kết hidro giữa các base chứa nitơ: Adenin - Uracil và Guanin - Cytosine. Cấu trúc không gian này chính là cấu trúc bậc hai của phân tử RNA. Ví dụ, các RNA vận chuyển (rRNA) có mạch polynucleotide cấu tạo từ 75 -90 gốc mononucleotide tự xoắn trong không gian tạo nên hình lá chẽ 3 (cấu trúc bậc hai) mà nhờ nó phân tử tRNA mới thực hiện ñược chức năng của mình. Hình 4.9. Cấu tạo của RNA vận chuyển (tRNA) a. RNA thông tin (mRNA) chỉ chứa 4 base chứa nitơ tức là A, G, C và ñược tổng hợp trên khuôn DNA, trong ñó trình tự của các base trong mạch của nó bổ sung hoàn toàn trình tự các base chứa nitơ trong một mạch DNA vốn dùng làm khuôn (quá trình phiên mã). mRNA vừa hình thành sẽ ñi vào tế bào chất, ở ñây nó ñược sử dụng làm khuôn và chịu trách nhiệm về trình tự sắp xếp các aminoacid trong quá trình tổng hợp protein. Mỗi một mRNA mang một mã di truyền cho một hoặc nhiều phân tử protein. Mỗi tế bào chứa hàng trăm mRNA khác nhau khó có thể phân lập ñược dưới dạng tinh sạch. b. RNA vận chuyển (tRNA) là những phân tử tương ñối nhỏ hoạt ñộng như những chất vận chuyển các aminoacid ñặc hiệu trong quá trình tổng hợp protein. Chúng có khối lượng phân tử trong khoảng 23000 ñến 30000 và chứa từ 75 ñến 95 gôc mononucleotide. Mỗi một aminoacid trong số 20 aminoacid tìm thấy trong protein có Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……77 một hoặc nhiều hơn tRNA tương ứng. Hiện nay người ta ñã tìm thấy hơn 60 tRNA có thể tồn tại ở dạng tự do hay dạng "gắn" với aminoacid ñặc hiệu bằng phản ứng este hoá giữa các nhóm cacboxyl của acid và nhóm - OH ở phía 3' của nucleotide ñầu mạch polynucleotide. ðiểm ñặc trưng cho tRNA là chúng có một lượng khá lớn các base hiếm (ñến 10% tổng các base chứa nitơ). Hầu như tất cả các tRNA ñều chứa 3 gốc guanilic acid ở một ñầu mạch và bộ ba C-C-A ở ñầu khác. Nhóm - OH 3' của adenilic acid cuối cùng là chất nhận aminoacid ñặc hiệu mà tRNA chịu trách nhiệm vận chuyển. Một phần ñặc trưng của các tRNA là bộ ba nucleotide (trinucleotide) vốn ñược gọi là ñối một mã (anticodon); chinh nhờ nó ñể nhận biết một bộ ba nucleotide (trinucleotide) trên mRNA vốn gọi là một mã di truyền (codon). Nhiều tRNA ñã ñược phân lập dưới dạng ñồng nhất và một số trong chúng ñã ñược tinh thể hoá. Năm 1965 R.Holley và cộng sự ñã thiết lập ñược hoàn chỉnh trình tự các nucleotide của tRNA-Alanin của nấm mốc. 4.3. SINH TỔNG HỢP NUCLEIC ACID 4.3.1. Sinh tổng hợp nucleotide dạng purine Quá trình sinh tổng hợp nucleotide dạng purine (Hình 4.10) ñược bắt ñầu từ α - D - Ribose-5-phosphate - sản phẩm của quá trình pentosephotphate. Sự tổng hợp các base purine xảy ra bằng cách gắn lần lượt các gốc acid khác nhau vào C1 của ribose và dẫn ñến các ribonucleotide một cách trực tiếp. Sản phẩm trung gian quan trọng là inosinic acid. Sau ñó từ acid này hình thành nên các nucleotide khác nhau. Các phản ứng dẫn ñến sự hình thành các base purine xảy ra như sau: α- D-ribose - 5- phosphate (Rib- 5-P) bị photphoryl - hoá nhờ sự xúc tác cuả enzyme pyrophotphate - transferase khi có mặt của ATP ñể hình thành α- 5-phosphoribosil-1-pyrophosphate (PRPP), sau ñó biến thành β-5-photphoribosil-amine (PRA). Ở phản ứng này glutamin là chất cho nhóm-NH2, sản phẩm của phản ứng này là glutamic acid và pyrophotphate. Ngoài sự gắn nhóm amin còn xảy ra sự thay ñổi cấu hình (liên kết α-glycoside biến thành β- glycoside). Không loại trừ khả năng là nhờ tác nhân ñã nêu mà giai ñoạn này là giai ñoạn then chốt trong quá trình sinh tổng hợp các base purine và nó bị kìm hãm bởi các nucleotide dạng purine vốn tạo thành từ phosphoribosilamin nhờ mối liên hệ ngược. Nhờ phản ứng với glycine khi có mặt ATP, glycinamide ribonucleotide (GAR) sẽ ñược hình thành, trong ñó nhóm cacboxyl của glycine liên kết với nhóm amin của PRA bằng liên kết amide. Mạch ñược kéo dài nhờ gắn nhóm formyl từ N5,10-methynil-tetrahidrofolic acid thành formyl –glycinamide ribonucleotide (FGAR). Khi có mặt ATP, liên kết amide của FGAR biến thành nhóm amindin nhờ glutamin-chất cho nhóm NH2, khí ñó sẽ tạo thành α-N-focmylglycinamidinribonucleotide (FGAM). Khi có mặt một phân tử ATP khác, một phân tử nước sẽ bị loại, vòng imidazol ñược khép kín và tạo thành 5-aminoimidazol ribonucleotide (AIR). Sự gắn nhóm CO2 vào mạch có lẽ xảy ra trực tiếp không có sự tham gia của một coenzyme nào ñó, kết quả là tạo thành 4-cacboxy -5-amino-imidazole-ribonucleotide. ở phản ứng 2 giai ñoạn tiếp theo có ATP và aspactic acid tham gia, ở giai ñoạn 1 tạo thành 5-aminoimidazole-4-succynilocacboxamide-ribonucleotde, sau ñó ở giai ñoạn 2 fumarate bị loại ra khỏi phân tử của nó và tạo thành 5-aminoimidazol-4-cacboxamide ribonucleotide (AICAR). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……78 Hình 4.10. Sinh tổng hợp các base purine Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……79 Nguyên tử cacbon cuối cùng của gốc pyrimidine của vòng purine ñược ñưa vào dưới dạng focmyl vốn liên kết với nhóm amin ở vị trí số 5. Trong phản ứng này chấ cho gốc focmyl là N10-focmyl-tetrahidofolic. Sự hình thành vòng purine ñược két thúc nhờ quá trình vòng hoá kèm theo sự loại nước. Kết quả là tạo thành nucleotide dạng purine ñầu tiên tức là inosinic acid (IMP). Guanilic acid (GMP) ñược tạo thành từ IMP qua 2 giai ñoạn. Bằng sự oxi hoá IMP ñể tạo thành xanthi-monophosphate, sau ñó nhờ thay thế oxi của C=O bởi nhóm NH2 (glutamin là chất cho NH2 khi có mặt ATP) sẽ tạo thành guanilic acid (GMP). Sự biến ñổi của guanilic acid (GMP) hay adenilic acid (AMP) thành CTP hay ATP xảy ra do sự phosphorin-hoá qua 2 giai ñoạn: GMP +ATP=GDP +ADP GDP +ATP= CTP+ADP Adenilic acid (AMP) ñược hình thành từ inosinic acid (IMP) bằng cách thay thế oxi trong C=O nhờ nhóm -NH2 mà chất cho nhóm -NH2 là aspactic acid. Sản phẩm trung gian của phản ứng là adenilosucxilic acid. AMP thu ñược có tác dụng ñiều hoà sinh tổng hợp các base purine trong giai ñoạn ñầu của quá trình trao ñổi chất với tư cách là một chất ức chế dị không gian của enzym aminotransferase và bằng cách này sẽ ức chế sự tổng hợp photphoribozilamin. Ngoài ra AMP còn ñiều hoà sự biến ñổi của inosinlic acid thành adelinosucxilic acid. 4.3.2. Sinh tổng hợp các nucleotide kiểu pyrimidine Cacbamoil-photphat là hợp chất khởi ñầu trong quá trình tổng hợp các nucleotide kiểu pirimodin. Nó ñược hình thành từ CO2 và nhóm -NH2 của glutamin nhờ sự xúc tác của enzyme carbamoylphosphate-sinthetase. Carbomoylphosphate vừa ñược tổng hợp sẽ ngưng kết tiếp tục với aspactic acid ñể tạo thành carbomoil-aspactic acid. Dưới tác dụng của dihidroorotase hợp chất này bị vòng hoá thành dihidroorotic acid. Acid này bị oxi-hoá bởi enzyme dihidroorotate - dehidrogenase và tạo thành orotic acid. Orotic acid biến thành orotidin-5'-phosphate (orotidilic acid - OMP) trong phản ứng do OMP-pyrophosphate-transferase xúc tác. OMP bị khử carboxyl-hoá thành uridilic acid (UMP). UMP là tiền thân của các nucleotide cytidine, trước hết nó bị photphoryl-hoá thành UTP: ` UMP + ATP → UDP + ADP UDP +ATP →UTP + ADP Chỉ có UTP mới biến thành CTP. Glutamine là chất cho nhóm -NH2. 4.3.3. Sinh tổng hợp các nucleotide thymidine dTMP ñược tạo thành từ dUMP dưới tác dụng của enzyme thymidilate-synthetase (khi có mặt của N5.10-methylentetrahidrofolic acid. Coenzyme này có thể hoạt ñộng như chất cho cả nhóm methyl và hidro. Sản phẩm biến ñổi cuối cùng của coenzyme là dihidrofolic acid (FH2) chất tiền thân trực tiếp trong qúa trình sinh tổng DNA là dTTP vốn ñược tạo thành trong phản ứng 2 ở giai ñoạn sau: dTMP + ATP → dTDP + ADP dTDP + ATP → dTTP + ADP Những phản ứng này do các phosphatetransferase xúc tác. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……80 Hình 4.11. Sinh tổng hợp các base pyrimidine 4.3.4. Sinh tổng hợp các deoxyribonucleotide Các deoxyribonucleotide ñược hình thành từ các ribonucleotide theo phương thức các ribonucleotide phosphate nhờ sự khử ribose thành 2-deoxyribose. Chất cho ñiện tử là Thioredoxin-một protein bền ñối với nhiệt vốn chứa trong 2 phân tử nhóm-SH. Dạng oxi hoá của thioredoxin (>S2) bị khử bởi thioredoxin-reductase khi có mặt NADPH. Phản ứng xảy ra qua 2 giai ñoạn: Enzyme β1 vµ β2 1. Thioredoxin-(SH) 2 + CDP Thioredoxin-S 2 + dCTP 2+ Mg + 2. Thioredoxin-S2 + NADPH + H+ Thioredoxin-(SH)2 + NADP Thioredoxin-reductase 4.3.5. Sinh tổng hợp DNA (sự tái bản DNA - Replication) ðể cho quá trình sinh tổng hợp DNA xảy ra ñược cần có ít nhất các ñiều kiện sau ñây: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……81 Phải có mặt ñầy ñủ 4 loại deoxyribonucleotide dưới dạng triphosphate: dATP, dGTP, dCTP và dTTP. - Phải có các enzyme DNA-polymerase xúc tác. Ở E.coli gồm 3 enzyme: DNApolymerase I, II và III. DNA-polymerase III xúc tác việc gắn dần các gốc mononucleotide vào ñầu 3’ – OH. DNA-polymerase I xúc tác việc loại các RNA mồi (RNA primer), sửa chữa sai sót của DNA trong quá trình tái bản. DNA-polymerase II sửa chữa SOS các sai sót trong quá trình tái bản. - Phải có DNA làm khuôn. Theo A.Konberg có thể trình bày tóm tắt quá trình sinh tổng hợp DNA như sau: - ndATP + ndGTP + ndCTP + ndTTP dAMP + DNA-Polymerase, Mg2 dGMP DNA lµm khu«n dCMP + 4nPP dTMP n DNA Tuy nhiên cơ chế của quá trình tái bản DNA - một thuộc tính ñặc trưng của các cơ thể sống xảy ra rất phức tạp và cho ñến ngày nay dần dần ñược làm sáng tỏ. Năm 1958 Meselson M. và Stahl F. nhờ việc sử dụng 14N và 15N ñã chứng minh là sự tái bản DNA xảy ra theo cơ chế bán bảo tồn, nghĩa là từ một DNA cha mẹ tổng hợp nên 2 phân tử DNA con mới trong ñó có một mạch DNA là một mạch DNA cha mẹ còn một mạch khác ñược tổng hợp mới. Cơ chế bán bảo tồn của sự tái bản DNA ñã giải thích ñược cơ chế di truyền của các cơ thể sống. Trong những năm gần ñây nhờ việc nghiên cứu tiếp tục các yếu tố tham gia vào quá trình tá bản DNA của E.coli ñã cho phép hiểu rõ hơn cơ chế tái bản DNA. Quá trình tái bản DNA có thể chia ra làm 3 giai ñoạn. a. Giai ñoạn mở ñầu Ở E.coli ñể cho quá trình tái bản DNA xảy ra ñược cần: - Trình tự nucleotide gắn ñặc hiệu với các protein mở ñầu - Tổng hợp RNA mồi (RNA primer) ñể DNA-polymerase III gắn dần dần các gốc mononnucletide vào ñầu 3’ – OH. Trình tự mở ñầu ở E.coli Ori là trình tự gồm 245 bp. Nó chứa 4 trình tự lặp lại với 9 bp có vai trò gắn các protein mở ñầu Dna A – protein. Ở phía trái có 3 trình tự lặp lại với 13 bp giàu A và T và nó rất dễ bị biến tính. Trình tự này cũng có vị trí gắn cho một số protein kiềm tính (HU và IHF) tạo thuận lợi cho sự uốn cong DNA. Giai ñoại mở ñầu chia làm 3 bước. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……82 Hình 4.12. Giai ñoạn mở ñầu của quá trình tái bản * Bước 1: Phức hợp 10 – 20 phân tử Dna A-protein và ATP ñược gắn vào trình tự mở ñầu với 4 trình tự lặp lại. Sau ñó các protein kiềm tính gắn vào vùng với 3 trình tự lặp lại. Phức hợp này tạo ñiều kiện ñể cho DNA mở xoắn một phần. * Bước 2: Với sự tham gia của Dna C protein, Dna B Helicase gắn vào 2 mạch DNA, mở xoắn DNA. * Bước 3: Dna G Primase gắn vào và tổng hợp RNA mồi. Khi có RNA mồi, quá trình tổng hợp 2 mạch DNA bắt ñầu (Hình 4.12). b. Giai ñoạn tổng hợp Chẽ ba tái bản ñược hình thành (Hình 3.13), DNA-Polymerase III trượt trên hai mạch DNA và gắn các gốc deoxyribonucleotide vào ñầu 3’-OH. Mạch hướng (leading strand) ñược tổng hợp liên tục theo hướng 5’-3’. Mạch kế tiếp (lagging strand) ñược tổng hợp dưới dạng các ñoạn ngắn Okazaki (1000-2000 mononucleotide) bắt ñầu bằng các RNA mồi. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……83 Hình 4.13. Mô hình cấu tạo chẽ ba tái bản (Replication fork) c. Giai ñoạn hoàn thiện mạch kế tiếp Dưới sự xúc tác của DNA-Polymerase I với hoạt tính 3’-exonuclease các RNA mồi ñược cắt bỏ. Sau ñó dưới sự xúc tác của DNA-Polymerase III xảy ra sự tổng hợp lấp ñầy các khoảng trống. Enzyme DNA Ligase xúc tác việc gắn các ñoạn lại với nhau tạo thành mạch kế tiếp của DNA liên tục (Hình 4.14). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……84 Hình 4.14. Giai ñoạn tổng hợp và hoàn thiện mạch kế tiếp 4.3.6. Sinh tổng hợp RNA ( sự phiên mã-Transcription) Cũng tương tự như quá trình sinh tổng hợp DNA, ñể cho quá trình sinh tổng hợp RNA xảy ra cần có các ñiều kiện sau ñây: - Có mặt của 4 nucleotide-5'-triphosphate: ATP, GTP, CTP và UTP. - Có DNA làm khuôn. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……85 - Có enzyme RNA-polymerase xúc tác. Theo A. Konberg có thể trình bày tóm tắt quá trình sinh tổng hợp RNA như sau: nATP + nGTP + nCTP + nUTP AMP + RNA-Polymerase, Mg2 GMP DNA lµm khu«n CMP + 4nPP UMP n RNA Enzyme RNA-Polymerase xúc tác cho sự phiên mã trình tự các base của DNA thành trình tự các base của RNA. Ở E.coli RNA-Polymerase cấu tạo từ 2 tiểu phần α và 2 tiểu phần β1 và β2. 4 tiểu phần này hợp lại thành enzyme "lõi" chưa có hoạt tính. Khi tiểu ñơn vị σ (sigma) kết hợp vào mới tạo nên phân tử RNA-Polymerase có hoạt tính. Ở các tế bào nhân thật ngày nay ñã phát hiện thấy có 3 RNA-Polymerase: RNAPolymerase I, II và III. RNA-Polymerase I xúc tác phiên mã khoảng 60% tổng lượng RNA, chủ yếu là RNAr (28S, 18S và 5,8S); RNA-Polymerase II xúc tác phiên mã khoảng 30% tổng lượng RNA, chủ yểu là các RNAm và một số RNAs; RNAPolymerase III xúc tác phiên mã khoảng 10% tổng lượng RNA, chủ yếu là các RNAt, RNAr 5S và một số RNAs (U1, U2, U3). RNA-Polymerase xúc tác phản ứng chuyển nhóm nucleosityl. Hình 4.15. Sơ ñồ tổng hợp RNA Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……86 Thành phần tiểu ñơn vị của RNApolymerase là α2ββ’σ. Holoenzyme gồm enzyme “lõi” và σ. Khi phiên mã bắt ñầu σ phân ly khỏi Holoenzyme Hình 4.16. Cấu tạo của RNA-Polymerase Quá trình phiên mã RNAm có thể chia thành 3 giai ñoạn (Hình 4.17, 4.18). a. Giai ñoạn mở ñầu RNA-Polymerase hoạt ñộng gắn vào DNA và trượt tự do trên DNA. Khi gặp trình tự mở ñầu RNA-Polymerase tạo với gen khởi ñộng (Promoter) phức hợp Promoter “ñóng”trong ñó DNA chưa mở xoắn. Sau ñó phức hợp Promoter “ñóng” chuyển sang dạng phức hợp Promoter “mở” trong ñó DNA ñược cởi xoắn. Phức hợp này gắn pppPu vào và quá trình tổng hợp bắt ñầu (Hình 5.17). Trình tự mở ñầu là trình tự nucleotide có 2 vùng “bảo thủ” giống nhau ở các loài là vùng-10: TATAAT và vùng -35: TTGACA.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……87 Hình 4.17. Giai ñoạn mở ñầu và tổng hợp mạch ribonucleotide Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……88 Hình 4.18. Giai ñoạn kết thúc sinh tổng hợp RNA Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá sinh ñại cương.........................……… ……89 4.4. PHÂN GIẢI CÁC NUCLEIC ACID Trong quá trình trao ñổi chất các phân tử DNA và RNA không cần thiết nữa sẽ bị phân giải dưới tác dụng của các nuclease (deoxyribonuclease, ribonuclease) thành các mononucleotide. Các mononucleotide có thể ñược dùng ñể tổng hợp các phân tử nucleic acid mới, hay bị phân giải tiếp tục. Các mononucleotide bị biến ñổi thuỷ phân bằng các enzyme (phosphatase, nucleosidase) ñể hình thành các sản phẩm cuối cùng: các base purine và pyrimidine. Các base purine bị phân giải thành uric acid ñược ñào thải ra ngoài cơ thể. Quá trình này ñiển hình cho các ñộng vật có xương sống ( trong ñó có vượn người và người), chim và bò sát. ðối với ñộng vật có xương sống và bò sát khác, sản phẩm phân giải cuối cùng các base purine là allantoin. Trong cơ thể các allantoin bị phân giải thành urê. Các base pyrimidine thường hay bị phân giải thành ure và amoniac. Câu hỏi ôn tập: 1. Thành phần hoá học của nucleic acid? 2. Nucleoside, Nucleotide. ðơn vị cấu tạo của DNA và RNA? 3. Cấu tạo của DNA (cấu trúc bậc nhất và mô hình chuỗi xoắn kép) 4. Cấu tạo của các RNA 5. Sinh tổng hợp các nucleotide 6. Quá trình tái bản DNA 7. Quá trình phiên mã RNA 8. Phân giải nucleic acid Tài liệu tham khảo: 1. Ngô Xuân Mạnh (chủ biên), Vũ Kim Bảng, Nguyễn ðặng Hùng, Vũ Thy Thư (2006). Giáo trình hoá sinh thực vật. Nxb Nông nghiệp. 2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2007). Hoá sinh ñại cương. Nxb Giáo dục (tái bản lần thứ 7) 3. Nelson D. L., Cox M. M. (2005). Lehninger’s Principles of Biochemistry, Fourth Ed., Freeman and Company, New York, USA. 4. Mathews C.K., van Holde K.E., Ahern K.G. (2000). Biochemistry, Third Ed., Addison Wesley Longman Inc. |
