MPN là gì, CFU là gì? Hai thuật ngữ này có gì khác nhau. Hãy cùng các chuyên gia của Nihophawa theo dõi và tìm hiểu qua bài viết này. Show MPN là gì?MPN viết tắt của Most probable number. Đây là phương pháp sử dụng ước tính nồng độ các vi sinh vật khả thi trong 1 mẫu bằng cách tái tạo sự tăng trưởng của vi sinh trong nước pha loãng gấp 10 lần. Phương pháp này thường sử dụng để ước tính quần thể vi sinh vật trong đất, nước, nông sản và đặc biệt hữu ích với các mẫu có chứa vật liệu hạt. Mục đích áp dụng MPNMPN được áp dụng phổ biến trong kiểm tra chất lượng nước. Tức là đảm bảo an toàn về mặt số lượng vi khuẩn trong đó. Một nhóm vi khuẩn được gọi là coliform đóng vai trò báo hiệu chỉ số ô nhiễm phân của nước. Sự hiện diện ít vi khuẩn coliform phân thể hiện nước không chứa sinh vật gây bệnh. Trong khi sự hiện diện của lượng vi khuẩn coliform lớn sẽ thể hiện khả năng rất cao là nước chứa sinh vật gây bệnh. Làm cho nước không an toàn để sử dụng.  MPN được coi là yếu tố quan trong trong việc kiểm định chất lượng vi khuẩn trong nước thải có đảm bảo an toàn khi thải ra môi trường. Đây cũng là một chỉ số giúp đánh giá hiệu quả của hệ thống xử lý nước thải y tế phòng khám của Nihophawa hiện nay. Nguyên tắc thử nghiệm MPNMẫu nước được pha loãng và tiêm vào nước dùng đường sữa. Khuẩn coliform có trong nước sẽ sử dụng đường sữa trong dung môi để tạo ra axit và khí. Sụ hiện diện của axit được biểu thị bằng sụ đổi màu của môi trường và sự hiện diện của khí. Như bọt khí thu được từ môi trường dung moi. Số lượng coliform tổng được xác định bằng cách đêm số lượng ống khí cho phản ứng dương tính (nghĩa là thay đổi cả màu sắc và có sản xuất khí). So sánh mô hình kết quả dương tính với bảng tiêu chuẩn. Thực hiện kiểm tra MPNCác bước kiểm tra MPN bao gồm: Các thử nghiệm giả định bao gồm 1 xét nghiệm sàng lọc lấy mẫu. Nếu xét nghiệm là âm tính, không cần thực hiện thêm thử nghiệm nào nữa. Có thể kết luận nước đảm bảo về mặt vi sinh. Tuy nhiên, nếu nước xuất hiện axit và khí, nước được coi là không an toàn. Thử nghiệm được xác nhận trên ống thể hiện phản ứng dương tính. Một số loại vi sinh vật khác ngoài coliform cũng tạo axit và khí trong quá trình lên men đường latose. Để xác nhận sự hiện diện của coliform, cần tiến hành thử nghiệm xác nhận. Mỗi ống lên men có kết quả dương tính cần chuyển sang: + 3 ml nước dùng đường latose hoặc ống đã lên men đường latose màu xanh sáng. + 1 môi trường thạch + 3 ml nước tryptone. Sau đó thử nước. Vì 1 số kết quả xét nghiệm dương tính có thể sai. Vì vậy mỗi chủng từ mỗi ống nghiệm dương tính cần được xác nhận. Sau khi ủ, tất cả các đãi được kiểm tra sự hiện diện của khuẩn lạc điển hình do coliform tạo ra. Sự hiện diện của khuẩn lạc ở nhiệt độ cao cho thấy sự có mặt của Ecoli nhiẹt. Khái niệm CFU là gì?Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU là đơn vị được sử dụng trong vi sinh để ước tính số lượng vi khuẩn hoặc tế bào nấm khả thi trong 1 mẫu nhất định. Khả thi được định nghĩa là khả năng nhân lên thông qua quá trình phân hạch nhị phân ở điều kiện kiểm soát. Tính toán CFU đòi hỏi phải nuôi cấy các vi khuẩn, chỉ đếm các tế bào khả thi. Ngược lại, đếm bằng kính hiển vi là đếm toàn bộ cả tế bào sống và tế bào chết. Sự xuất hiện trực quan của CFU trong nuôi cấy tế bào đòi hỏi phải có sự tăng trưởng đáng kể. Khi đếm vi khuẩn lạc cần chắc chắn chúng được sinh ra từ 1 hoặc 1 nhóm tế bào. Kết quả biểu thị các đơn vị hình thành khuẩn lạc không phân biệt. Mục đích của việc tính toán CFUMục đích của việc đếm và ước tính số lượng tế bào hiện diện, dựa trên khả năng tạo ra các khuẩn lạc trong 1 diều kiện cụ thể về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ và thời gian. Về lý thuyết, tế bào khả thi có thể tạo ra 1 tập khuẩn lạc thông qua sao chép. Tuy nhiên các tế bào đơn ngoại lệ trong tự nhiên khi kết hợp cũng tạo ra 1 quần thể khuẩn lạc. Ngoài ra, nhiều vi khuẩn phát triển thành chuỗi hoặc cục. Vì vậy, ước tính số lượng vi sinh vật bằng CFU có thể vượt qua số lượng tế bào sống có trong 1 mẫu. Lý do là việc đếm CFU giải định mọi quần thể khuẩn lạc đều tác biệt và được thành lập bởi 1 tế bào vi sinh duy nhất. Thực hiện kiểm tra CFU là gì?Các đơn vị hình thành khuẩn lạc thường sử dụng để định lượng kết quả đếm vi sinh bao gồm:
Với kỹ thuật sử dụng thạch, không thể sử dụng các dung dịch chất lỏng. Vì độ tinh kiết của mẫu thử không thể xác định và đếm từng tế bào trong chất lỏng. Sự khác biệt giữa MPN và CFU là gì?Câu trả lời là 2 phương pháp tương đương nhau. MPN tương đương với CFU. Cả 2 đơn vị đo số lượng vi khuẩn ước tính trong 1 mẫu. Cả 2 đều được công nhận bởi nhiều tổ chức, cơ quan khoa học và quy định trên toàn thế giới. Việc sử dụng MPN hay CFU dựa trên phương pháp phát hiện vi khuẩn. Và cả 2 đều hợp lệ. Đối với CFU, vi khuẩn phát triển trên môi trường rắn như thạch. Sau đó, đếm khuẩn lạc. Còn đối bới MPN, các mẫu được phát triển trong dung môi lỏng. Các ống nghiệm dương tính được tính toán và so sánh để tạo ra kết quả. Tóm lại là các phòng thí nghiệm, các quan trên toàn thế giới đều sử dụng MPN và CFU thay thế cho nhau. Cả 2 phép đo đều được thiết lập để ước tính số lượng vi khuẩn trong 1 mẫu. Độ tin cậy vào khoảng 95%. Các phương pháp màng lọc trong CFR đòi hỏi nhiều bước và mất nhiều thời gian hơn để có kết quả. Hi vọng với bài viết này của nihophawa.com.vn, các bạn đã hiểu thêm về 2 thuật ngữ liên quan tới vi sinh MPN, CFU là gì?
Để đảm bảo an toàn thực phẩm cần phải có phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm. Bài viết này sẽ phân tích sơ về điểm mạnh và hạn chế của một số phương pháp kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm đang được sử dụng phổ biến hiện nay. HIỂU RÕ VỀ KHÁI NIỆM VI SINH THỰC PHẨM Vi sinh thực phẩm hay nói đúng hơn là vi sinh vật (VSV) gây bệnh hiện diện trong thực phẩm. VSV gây bệnh hiện diện trong thực thực phẩm ở nhiều trạng thái khác nhau và vấn đề đầu tiên là cần phải hiểu rõ trạng thái nào sẽ có nguy cơ gây mất an toàn thực phẩm.
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM 1. Phương pháp nuôi cấy Nuôi cấy thường được xem là "tiêu chuẩn vàng" (gold standard) trong phân tích vi sinh thực phẩm. Phương pháp nuôi cấy truyền thống dựa trên khả năng tăng sinh tạo khuẩn lạc của vi khuẩn trong môi trường phòng thí nghiệm (Hình 1). Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy là nhạy, rẻ và dễ thực hiện, cung cấp thông tin về chất lượng, số lượng và cả chủng loại vi sinh vật sống hiện diện trong thực phẩm. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp nuôi cấy là rất tốn thời gian. Để có thể phát hiện được vi sinh thực phẩm cần phải thực hiện rất nhiều bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và rồi còn phải tái xác nhận lại bằng các kiểm nghiệm sinh hóa và huyết thanh. Thông thường cần tốn khoảng 1 tuần để thực hiện toàn bộ quy trình trên và định danh được vi sinh vật. Chưa kể, sự phân bố không đồng đều của vi sinh trong mẫu và sự hiện diện của các vi sinh bản địa có thể làm ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và tính chính xác của quy trình nuôi cấy. Không chỉ có vậy, phương pháp nuôi cấy gặp nhiều hạn chế nếu VSV trong mẫu thực phẩm ở trạng thái tổn thương hoặc VBNC.
2. Phương pháp không nuôi cấy Chính vì hạn chế về thời gian của phương pháp nuôi cấy, các phương pháp xét nghiệm vi sinh thực phẩm không nuôi cấy đã ra đời. Trong đó 2 nhóm phương pháp dựa trên nucleic acid và dựa trên thực khuẩn thể (bacterio phage) được đánh giá là có nhiều tiềm năng và hứa hẹn sẽ có thể thay thế phương pháp nuôi cấy truyền thống. a) Phương pháp dựa trên nucleic acid nhắm đến việc phát hiện DNA/RNA của VSV gây bệnh. Phổ biến nhất trong nhóm này là các phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR, ưu điểm của các phương pháp này là nhanh chóng, nhạy và đặc hiệu. Dù vậy do mục tiêu là DNA/RNA nên kết quả dương tính có thể là do xác VSV, vì vậy các nhà khoa học đã phải cải tiến kỹ thuật PCR bằng cách kết hợp sử dụng các thuốc nhuộm tế bào sống, phương pháp này được gọi là "viability PCR" (vPCR) (Hình 2). Trong phương pháp vPCR, đầu tiên tế bào sẽ được nhuộm với ethidium monoazide (EMA) hoặc propidium monoazide (PMA). Các chất như EMA và PMA sẽ bám vào DNA, tuy nhiên chúng không thể xuyên qua lớp màng tế bào nguyên vẹn nên chỉ có thể bám vào DNA của tế bào có lớp màng không còn nguyên vẹn. Khi được chiếu sáng, các đoạn DNA bị bám bởi EMA hoặc PMA sẽ bị tổn thương không thể phục hồi dẫn đến ức chế mạnh mẽ phản ứng PCR. Không chỉ có PCR, cả các kỹ thuật qPCR và LAMP cũng có thể sử dụng EMA hoặc PMA để phân biệt tế bào sống với tế bào chết theo nguyên lý tương tự. Dù vậy, kỹ thuật vPCR chỉ dựa trên tính toàn vẹn của màng tế bào nên phát hiện các tế bào trạng thái tổn thương không hiệu quả (âm tính giả) và lại cho tín hiệu PCR với các tế bào đã bất hoạt (dương tính giả). Hơn nữa, trong một số giai đoạn sinh trưởng thì thành tế bào vi khuẩn cũng bị đục lỗ một cách tự nhiên nên nếu mẫu được lấy ở các giai đoạn này sẽ cho kết quả không chính xác (âm tính giả).
Phương pháp RT-PCR cũng được đưa vào sử dụng nhằm phát hiện "tế bào sống" thông qua sự hiện diện của RNA thông tin (mRNA), mRNA là bằng chứng cho hoạt động sinh tổng hợp của tế bào. Trong kỹ thuật RT-PCR, mRNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA (giai đoạn RT) rồi sau đó được khuếch đại nhờ phản ứng PCR. Dù vậy, kỹ thuật RT-PCR không thật sự được ưa chuộng trong xét nghiệm vi sinh thực phẩm, một phần có thể là do mRNA dễ bị phân hủy nên dễ gây ra âm tính giả. b) Phương pháp dựa trên bacterio phage là đề xuất cực kỳ thú vị cho xét nghiệm vi sinh thực phẩm, bởi vì phage xâm nhiễm trên vi khuẩn một cách cực kỳ đặc hiệu và hiệu quả. Không chỉ có vậy, phage chỉ xâm nhiễm trên vi khuẩn còn sống, vô tình điều này đã giải quyết hầu hết các thách thức trong xét nghiệm vi sinh thực phẩm. Xét nghiệm vết tan (plaque assay): là phương pháp xét nghiệm đơn giản dựa trên khả năng ly giải tế bào vi khuẩn của phage. Trong phương pháp này mẫu sẽ được ủ với phage, sau đó sử dụng chất diệt virus (chemical virucide) hoặc xử lý bằng phương pháp vật lý để tiêu diệt toàn bộ các phage ngoại bào. Ngay trước thời điểm bùng phát, mẫu sẽ được pha loãng ở nồng độ thích hợp và nuôi cấy trải trên đĩa thạch mềm cùng với vi khuẩn chỉ thị. Vi khuẩn chỉ thị có thể là bất kỳ vi khuẩn nào, miễn là chúng sinh trưởng nhanh và có khả năng nhiễm loại phage đang sử dụng. Đến thời điểm bùng phát, phage sẽ thoát khỏi tế bào trong mẫu và nhiễm vào các tế bào vi khuẩn chỉ thị xung quanh và sau khoảng 1 ngày ủ thì trên đĩa thạch sẽ xuất hiện những vết tan (plaque). Mỗi một vết tan được gọi là 1 PFU, chỉ số PFU/mL mẫu đại diện cho nồng độ vi khuẩn trong mẫu ban đầu (Hình 3). Điểm mấu chốt quyết định thành công của phương pháp xét nghiệm vết tan (plaque assay) là bước tiêu diệt các phage ngoại bào, nếu bước này không được xử lý tốt sẽ dẫn đến tình trạng dương tính giả. Để khắc phục tình trạng này, sau bước xử lý bằng chất diệt virus cần thêm một bước PCR để kiểm tra sự hiện diện của phage trong dịch ngoại bào trước khi đem mẫu đi nuôi cấy trên đĩa thạch mềm. Điều này khiến quy trình vốn đã khá mất thời gian (hơn 1 ngày) càng trở nên phức tạp nên vẫn cần được nghiên cứu cải tiến nhiều hơn để có thể áp dụng rộng rãi trong phòng kiểm nghiệm.
Xét nghiệm bằng qPCR/miễn dịch: là phương pháp xét nghiệm phát hiện những phage mới được tạo ra sau khi xâm nhiễm và ly giải tế bào chủ vi khuẩn. Trong phương pháp xét nghiệm miễn dịch, mẫu sẽ được ủ với một lượng phage dưới ngưỡng phát hiện của các bộ kit miễn dịch. Sau một thời gian nhất định, đem mẫu đã ủ đi xét nghiệm miễn dịch, nếu kết quả ra dương tính chứng tỏ phage đã tăng sinh và vượt ngưỡng phát hiệt của bộ kit. Phương pháp qPCR cũng sử dụng nguyên lý tương tự, phage bị cố định trên bề mặt vàng, silica hoặc cellulose đã biến đổi sẽ tiếp xúc với mẫu để gây nhiễm, mẫu sau khi được gây nhiễm sẽ chuyển sang môi trường nuôi cấy hoàn toàn mới để ủ tăng sinh. Sau một thời gian nhất định, dịch môi trường sẽ được thu nhận để thực hiện phản ứng qPCR phát hiện bộ gene của phage mới vừa hình thành. Các phương pháp này có thể phát hiện phage chỉ sau một hoặc một vài chu kỳ ly giải tế bào, vì vậy rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn từ 4 đến 8 giờ. Nghiên cứu cũng cho thấy phương pháp miễn dịch kém nhạy hơn so với qPCR một ít. Xét nghiệm bằng enzyme - cơ chất: là phương pháp giúp phát hiện những thành phần nội bào phóng thích ra ngoài môi trường thông qua sự phát quang sinh học từ phản ứng giữa enzyme với cơ chất. Có 3 cách phổ biến để phát hiện sự ly giải tế bào: - Phát hiện các marker nội bào có thể là adenosine-5 triphosphate, ATP, β-galactosidase. - Phát hiện sự tăng sinh của phage dựa trên luciferase, protease, alkaline phosphatase. - Phát hiện sự thay đổi độ dẫn điện của môi trường do các chất điện giải nội bào được phóng thích vào môi trường. KẾT LUẬN Mỗi phương pháp xét nghiệm vi sinh thực phẩm đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định. Phương pháp nuôi cấy vốn được xem là "tiêu chuẩn vàng" trong kiểm nghiệm vi sinh vẫn gặp khó khăn đối với VSV ở trạng thái sống nhưng không thể nuôi cấy, ngoài ra thời gian trả kết quả kiểm nghiệm cũng rất lâu. Vì vậy các phương pháp không nuôi cấy vẫn đang được nghiên cứu và phát triển để thay thế cho phương pháp nuôi cấy truyền thống, trong đó hiện tại có 2 nhóm phương pháp được quan tâm nhiều nhất đó là nhóm phương pháp xét nghiệm dựa trên nucleic acid (DNA/RNA) và nhóm phương pháp xét nghiệm dựa trên bacteriophage. Sơn Phạm - Lược dịch và tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Anany, H., Brovko, L., El Dougdoug, N. K., Sohar, J., Fenn, H., Alasiri, N., ... & Filipe, C. D. (2018). Print to detect: a rapid and ultrasensitive phage-based dipstick assay for foodborne pathogens. Analytical and bioanalytical chemistry, 410(4), 1217-1230. Fittipaldi, M., Nocker, A., & Codony, F. (2012). Progress in understanding preferential detection of live cells using viability dyes in combination with DNA amplification. Journal of microbiological methods, 91(2), 276-289. Foddai, A. C., & Grant, I. R. (2020). Methods for detection of viable foodborne pathogens: current state-of-art and future prospects. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-8. Stambach, N. R., Carr, S. A., Cox, C. R., & Voorhees, K. J. (2015). Rapid detection of Listeria by bacteriophage amplification and SERS-lateral flow immunochromatography. Viruses, 7(12), 6631-6641. |
