HPV Genotype Real-time PCRMỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝMục đíchXác định genotype của Human Papillomavirrus (HPV) trong bệnh phẩm đường sinh dục. Show Nguyên lýXác định genotype của HPV và dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR và reverse dot blot. CHUẨN BỊNgười thực hiệnNgười thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh. Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh. Phương tiện, hóa chấtPhương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương. Trang thiết bịMáy real-time PCR và hệ thống máy vi tính. Bộ lưu điện. Máy ủ nhiệt. Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml. Máy ly tâm 25000 x g. Tủ an toàn sinh học cấp 2. Máy vortex. Tủ lạnh 2ºC - 8ºC. Tủ âm sâu (-20ºC) hoặc (-70ºC). Micropipette các thể tích từ 5 µl - 1000 µl. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần. STT Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao Đơn vị Số lượng 1 Tăm bông vô trùng Cái 1,000 2 Găng không có bột tal Đôi 0,100 3 Khay đựng bệnh phẩm Cái 0,0001 4 Hộp vận chuyển bệnh phẩm Cái 0,001 5 Sinh phẩm chẩn đoán Test 1,000 6 Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng Test 1,200 7 Kit tách DNA Test 2,200 8 Ngoại kiểm (nếu có)* 0,020 9 ống Falcol 50 ml Cái 0,010 10 Eppendorf 1,7 ml Tube 2,200 11 Eppendorf 0,2 ml Tube 2,200 12 Đầu côn 10 µl có lọc Cái 2,200 13 Đầu côn 30 µl Cái 1,200 14 Đầu côn 200 µl có lọc Cái 5,200 15 Đầu côn 1 ml có lọc Cái 3,200 16 Water-DEPC Treated ml 1,000 17 Giấy thấm Cuộn 0,100 18 Giấy xét nghiệm Tờ 2,000 19 Sổ lưu kết quả xét nghiệm Tờ 0,001 20 Bút viết kính Cái 0,020 21 Bút bi Cái 0,010 22 Mũ Cái 0,020 23 Khẩu trang Cái 0,020 24 Găng tay Đôi 0,100 25 Găng tay xử lý dụng cụ Đôi 0,020 26 Quần áo bảo hộ Bộ 0,005 27 Dung dịch nước rửa tay ml 8,000 28 Cồn sát trùng tay nhanh ml 1,000 29 Dung dịch khử trùng ml 10,000 30 Khăn lau tay Cái 0,010 * Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm). Bệnh phẩmDịch quệt cổ tử cung, mảnh sinh thiết... Phiếu xét nghiệmĐiền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNHCác bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên. Lấy bệnh phẩmTheo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3. Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6. Tiến hành kỹ thuật:Bộ sinh phẩm HPV Genotype Real-time PCR (VD). Tách chiết DNA. Thực hiện phản ứng real-time PCR. Thực hiện phản ứng reverse dlot blot: Thực hiện với những mẫu dương tính ở bước 2.2. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢĐiều kiện của phản ứngChứng dương: có tín hiệu tại vị trí chứng dương. Những genotyp nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Những genotyp nguy cơ thấp: 6, 11, 42, 43, 61, 81. Nhận định kết quảMẫu có tín hiệu tròn xanh xuất hiện tại vị trí tương ứng với genotype nào thì kết luận mẫu dương tính với genotype đó. Một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype. Mẫu không có tín hiệu màu thì kết luận: Mẫu nhiễm HPV genotype khác ngoài genotype của bộ kit. In hình kết quảNHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍTất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm. Nguyên nhân 1Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường của khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu. Khắc phụcChiếu UV và vệ sinh khu vực thao tác bằng nước Javel để khử nhiễm. Tiến hành lại thí nghiệm thật cẩn thận. Nguyên nhân 2Kit bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR trong quá trình sử dụng. Khắc phụThay kit mới và thực hiện quá trình như hướng dẫn ở nguyên nhân 1. Trường hợp này không thể lấy kết quả, phải khắc phục và tiến hành lại thí nghiệm. Tín hiệu dương tính yếu, có thể do rửa nhiều và quá lâu làm cho tín hiệu dương tính nhạt hoặc màng lai không sạch vẫn còn màu xanh sẽ khó đọc kết quả. Khắc phụcPhải tuân thủ đúng điều kiện rửa. |