Hóa sinh học (biochemistry) là môn khoa học nghiên cứu sự sống ở mức độ phân tử, bao gồm thành phần hóa học của của cơ thể và nghiên cứu những chuyển hóa của các chất và năng lượng xảy ra trong quá trình hoạt động sống của con người, động vật, thực vật, vi sinh vật và cả virut. Việc nghiên cứu các chất có trong thành phần của cơ thể sinh vật là nhiệm vụ của tĩnh hóa sinh (stastic biochemistry). Tĩnh hóa sinh có quan hệ mật thiết với hóa học hữu cơ (organic chemistry). Việc nghiên cứu chuyển hóa hóa học xảy ra trong quá trình hoạt động sống của cơ thể nghĩa là nghiên cứu về mặt hóa học của sự trao đổi chất là nhiệm vụ vủa động hóa sinh (dynamic biochemistry). Tuy nhiên tĩnh hóa sinh và động hóa sinh có liên hệ chặt chẽ với nhau – việc nghiên cứu các quá trình hóa sinh học sẽ vô nghĩa nếu không có sự nghiên cứu các chất tham gia trong quá trình này. Hóa sinh học trở thành một ngành khoa học độc lập vào nửa sau của thế kỷ XIX, mặc dầu ngay từ thời thượng cổ con người đã làm quen với nhiều quá trình hóa sinh học trong cuộc sống hàng ngày của họ (nướng bánh mỳ, nấu rượu, thuộc da…) Ở thế ky XIX người ta đã đạt được những thành tựu to lớn trong lĩnh vực tĩnh hóa sinh và trong việc nghiên cứu sự trao đổi chất ở trong cơ thể sinh vật. Bằng các phương pháp nghiên cứu mới, Liebig đã xác định thành phần của nhiều thực phẩm, đã chia các chất chứa trong thực phẩm thành protein, gluxit, lipit và xác định hàm lượng nitơ trong protein. Các kết quả quan trọng trong việc nghiên cứu cơ chế hóa học của protein đã thu được nhờ các công trình của N.E. Liacopsky và A.I. Danilepsky. Năm 1884, Danilepsky lần đầu tiên đã điều chế được các chất giống protein nhờ enzim. Sau đó, Fischer đã tổng hợp được hàng loạt polipeptit. Năm 1880, N.I. Lunin đã phát hiện ra vitamin… Việc xác lập nên thành phần hóa học của thực vật, việc phát hiện ra các enzim và việc làm sáng tỏ vai trò của chúng trong trao đổi chất, sự phát hiện ra vitamin và hoocmon, sự phát triển của hóa học về axit amin và protein, về gluxit, lipit đã tạo điều kiện cho việc hình thành động hóa sinh. Đồng thời cũng nhờ sự phất triển của động hóa sinh mà người ta đã xây dựng được những quan điểm thống nhất về các quy luật chung của các quá trình trao đổi chất và của những chuyển hóa năng lượng trong cơ thể sinh vật.
Hóa sinh học là nền tảng của các môn sinh học thực nghiệm khác như Sinh lý học thực vật, Sinh lý học động vật, Vi sinh học, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học. Ngoài ra nó còn cung cấp những kiến thức cơ sở cho những ai làm việc trong lĩnh vực y, dược, nông lâm nghiệp, công nghiệp nhẹ… Bởi vậy, tùy theo đối tượng Hóa sinh học được chia ra thành Hóa sinh học thực vật, Hóa sinh học động vật, Hóa sinh học công nghiệp… Những năm gần đây, với sự ra đời và phát triển của ngành Công nghệ sinh học (Biotechnology) đã đánh dấu bước phát triển mới của Hóa sinh học đem lại những thành quả to lớn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Bằng phương pháp công nghệ sinh học có thể sản xuất các hoocmon như insulin, các kháng thể như intecferon có tác dụng phòng, chống lại sự xâm nhập của virut. Điểm ưu việt của phương pháp sản xuất này là giá thành hạ cho nên có thể đáp ứng cho số đông bệnh nhân. Trong lĩnh vực nông nghiệp, bằng phương pháp chuyển gen, người ta đã tạo ra được những giống cây trồng có chất lượng nông sản cao theo hướng mong muốn của con người, hoặc nghiên cứu tạo ra cho cây trồng có khả năng hấp thu và có định nitơ trong không khí, nhằm giảm bớt việc bón phân đạm…
Những đặc tính này được quy định do hai tính chất đặc trưng của cơ thể thực vật. Thứ nhất, đó là khả năng của thực vật có thể tổng hợp được các chất hữu cơ khác nhau từ CO2, H2O và các chất vô cơ từ đất. Thứ hai, đó là tính muôn màu muôn vẻ của các hợp chất hữu cơ đã được tổng hợp nên trong cơ thể thực vật. Ví dụ, động vật không có khả năng tổng hợp được tất cả các axit amin có trong thành phần của protein thì thực vật lại có khả năng đó. Hóa sinh học thực vật nghiên cứu thành phần hóa học của của cơ thể thực vật và những quá trình hóa sinh xảy ra trong cơ thể của chúng cho nên nó có ý nghĩa rất lớn đối với ngành trồng trọt và đối với hàng loạt ngành công nghệ thực phẩm. Ý nghĩa của của hóa sinh thực vật đối với ngành trồng trọt trước hết là ở chỗ việc nghiên cứu các quá trình trao đổi chất ở thực vật sẽ cho phép ta điều khiển sự phát triển của cơ thể thực vật nói chung và các và các cây trồng nông nghiệp nói riêng theo chiều mong muốn của con người. Việc xác lập các quy luật tổng hợp gluxit, protein, lipit, vitamin, ancanloit và những hợp chất khác ở thực vật sẽ cho phép ta tạo nên những điều kiện thuận lợi cho các cây trồng nông nghiệp nhằm đảm bảo việc thu hoạch một sản lượng cao nhất về các chất này. Sự thay đổi có định hướng quá trình trao đổi chất nhờ các phương pháp hóa sinh sẽ cho phép tạo nên những dạng cây trồng mới, những giống mới có giá trị về nông nghiệp. Cùng với việc nghiên cứu cơ chế hóa học của sự trao đổi chất ở bên trong cơ thể thực vật, người ta cũng tiến hành nghiên cứu những ảnh hưởng của nhiều yếu tố ngoại cảnh đối với các khâu riêng biệt của quá trình trao đổi chất và đối với sự thay đổi về lượng cũng như về chất trong thành phần hóa học của thực vật. Nhiệt độ, ẩm độ của đất, các đặc tính dinh dưỡng, số lượng và chất lượng ánh sáng, các điều kiện đất đai, kỹ thuật canh tác, tác dụng của chất kích thích sinh trưởng… đều thuộc các yếu tố ngoại cảnh. Sự thấu hiểu về các đặc tính hóa sinh của thực vât, sự hiểu biết về các quá trình trao đổi chất trong thực vật và các yếu tố ngoại cảnh có ảnh hưởng là rất cần thiết đối với một kỹ sư nông học để đạt được mục đích cuối cùng là thu hoạch được những năng suất cây trồng cao nhất, tốt nhất. Thêm vào đó, việc nghiên cứu một cách sâu sắc và toàn diện sự trao đổi chất ở thực vật và ở từng cơ quan bộ phận của chúng như hạt, củ, quả… đê có cách bảo quản tốt nhất cũng là một nhiệm vụ hết sức quan trọng.
Tận dụng những phương pháp nghiên cứu của các ngành khác mà Hóa sinh học có được sự phát triển nhanh chóng. Đó là các phương pháp hóa học, lý học, hóa lý…
Từ giữa thế kỷ XIX Wohler đã tổng hợp được chất hữu cơ đầu tiên là ure từ các chất vô cơ. Sau đó nhiều chất hữu cơ khác cũng được tổng hợp bằng con đường hóa học (peptit, hoocmon, vitamin… và ngay cả ARN vận chuyển alanin và ARN vận chuyển tirozin cũng được tổng hợp). Phương pháp xác định trình tự axit amin do Sanger đề ra (1953), nhờ đó lần đầu tiên ông xác định được cấu hình bậc nhất của insulin, sau đó phương pháp này được sử dụng để xác định cấu trúc bậc nhất của protein. Nhờ phương pháp nhân dòng ADN, người ta có thể thu được nhiều bản sao của một loại ADN xác định, nhằm tạo ra ở cơ thể nhận có khả năng tổng hợp một protein nhất định, ví dụ, tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp intecferon hoặc insulin.
Từ năm 1930 Linus Pauling và Robert Correy đã bắt đầu dung tia X để phân tích cấu trúc chính xác của axit amin và peptit, đã thu được độ dài của các liên kết và góc đo giữa các liên kết trong mạch peptit, từ đó dự đoán được cấu hình của protein. Năm 1953 Watson và Crick đã dùng nhiễu xạ tia X để nghiên cứu ADN và đề ra mô hình cấu trúc xoán kép của ADN. Cũng nhờ phương pháp này người ta đã biết được cấu trúc bậc ba và bậc bốn của nhiều chất khác nhau. Nhờ phương pháp đồng vị phóng xạ, người ta đã đi sâu nghiên cứu các quá trình trao đổi chất trong tế bào. Nhờ có kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 200 – 250 nghìn lần mà người ta có thể phát hiện các cấu trúc cỡ 10 A0 và chụp hình các bộ phân nhỏ nhất trong tế bào. 4.3 Phương pháp hóa lý Nhờ các phương pháp hấp phụ lựa chọn đã tách được các protein hoặc enzim ra khỏi hỗn hợp, chất thu được có độ tinh sạch cao. Ví dụ, có thể tách riêng tripxin và amilaza ra khỏi tụy tạng. Các phương pháp điện di, sắc kí đều được sử dụng rộng rãi, nhằm nghiên cứu thành phần và đặc điểm cấu tạo của các chất, cũng như để làm sạch và định lượng chúng. PHẦN 1: TĨNH HOÁ SINH Chương1: PROTEIN 1.1. CẤU TẠO HÓA HỌC, TÍNH CHẤT LÝ HÓA HỌC VÀ SINH HỌC CỦA PHÂN TỬ PROTEIN 1.1.1 Khái niệm chung Protein bắt nguộn từ chữ Hy lạp “protos” có nghĩa là “đầu tiên”. được J.Beczelius (Jons Beczelius, năm 1838) dùng để nhấn mạnh tầm quan trọng của nhóm chất này. Protein là nhưng chất có trọng lượng phân tử lớn ở trong cơ thể sống. Chúng được tạo thành từ một hoặc một số chuỗi polipeptit, mỗi chuỗi polipeptit bao gồm các gốc axit amin vốn được liên kết với nhau bằng liên kết peptit. Vì vậy khi phân tử protein bị thuỷ phân hoàn toàn dưới tác dụng của enzim tương ứng hoặc của axit đặc, kiềm đặc thì chúng tạo thành các axit amin. Trong thành phần của tất cả các loại protein đều có chứa các nguyên tố C, H, O, N và hầu hết chúng đều có chứa S, ngoài ra còn có các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu… Trong cơ thể sinh vật từ cơ thể đơn bào đến cơ thể đa bào, protein giữ một vai trò quan trọng nó quyết định mọi chu kỳ sinh trưởng và phát triển, mặc dù ở một số cơ thể hàm lượng protein rất thấp so với nhưng thành phần hoá học khác như lipit, gluxit… Một vài cơ thể như virus dạng đơn giản thì protein và nucleoproteit là các chất tạo nên chúng, còn ở các cơ thể động vật bậc cao thì protein có mặt ở hầu hết các tế bào nên việc nghiên cứu quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng không thể tách rời việc nghiên cứu protein. Trong tất cả các chất hữu cơ trong cơ thể sinh vật chỉ có protein là có tính chất xúc tác và các quá trình trao đổi chất đặc trưng đối với cơ thể sống đều tiến hành dưới tác dụng của các enzim có bản chất là protein. Protein có hàng loạt các đặc tính mà ta không thể tìm thấy ở bẩt kỳ một loại hợp chất hữu cơ nào khác. Những đặc tính này đảm bảo chức năng của các thể protein với tư cách là những chất mang sự sống. Có thể tóm tắt những nét cơ bản của nhứng đặc tính này như sau: - Tính muôn màu muôn vẻ trong cấu trúc và đồng thời tính đặc hiệu khá cao về loài của chúng.
Trước khi đi sâu vào các tính chất này, chúng ta hãy tìm hiểu cấu tạo hoá học của phân tử protein. Cấu tử cơ bản tạo nên phân tử protein là các axit amin. Vì thế trước khi trình bày về cấu trúc phân tử protein, chúng ta hãy xét về cấu tạo và những tính chất cơ bản của axit amin. 1.1.2 Cấu tạo của phân tử protein 1.1.2.1 Axit amin 1.1.2.1.1 Khái niệm Axit amin là dẫn xuất của axit hữu cơ aliphatic trong đó một nguyên tử H (đôi khi là 2) của gốc ankyl được thay thế bởi gốc amin (-NH2). Công thức tổng quát của axit amin như sau: R – CH - COOH NH2 R – là gốc của axit amin, chúng có thể bao hàm các gốc hydroxil (-OH), phenil (C6H5 -), thiol (- SH), các bazơ có nitơ với tư cách là các chất thế, một vài axit amin có hai gốc (-COOH) 1.1.2.1.2 Các axit amin thường gặp Trong tất cả các axit amin của phân tử protein thường gặp thì nhóm NH2 thường đính vào vị trí cacbon a so với nhóm cacboxil (- COOH). Tuy nhiên người ta cũng đã phát hiện được axit b- amin, đó là b- alanin trong thành phần của axit pantotenic, trong chiết của một số cây họ đậu. Có khoảng 20 axit amin tham gia cấu tạo nên protein và 1/2 trong số đó chỉ tổng hợp được ở thực vật. Người ta gọi nhưng axit amin mà người và động vật không tự tổng hợp được là những axit amin không thay thế. Dựa vào tính phân cực của gốc R ta chia các axit amin ra làm hai nhóm:
1, Glyxin (Gly): H – CH – COOH NH2 2, Alanin (Ala): CH3 – CH – COOH NH2 3, Valin (Val): CH3 CH – CH – COOH CH3 NH2 4, Leuxin (Leu): CH3 CH – CH2 CH – COOH CH3 NH2 5, Ixoleuxin (Ileu): CH3 – CH2 CH – CH – COOH CH3 NH2 6, Xystein (Xys): 7, Metionin (Met): 8, Prolin (Pro): 9, Phenilalanin (Phe): 10, Tryptophan (Try):
* Có 5 axit amin trung tính 1, Serin (Ser): 2, Treonin (Tre): 3, Tyrozin (Tyr): * Có 2 axit amin có tính axit: 1, Aspartic (Asp): 2, Glutamic (Glu): * Có 2 axit amin và amit + Asparagin: + Glutamin: * Có 3 axit amin có tính bazơ 1, Lyzin (Lyz): 2, Arginin (Arg): 3, Histidin (His): 2.1.2.1. Tính chất của axit amin2.1.2.1.1 Tính hoạt quang (đồng phân quang học) Tính hoạt quang là khả năng quay mặt phẳng phân cực của ánh s¸ng và tạo ra các chất đồng phân gương. Tính hoạt quang là một đặc tính quan trọng của các axit amin có trong thành phần protein. Trừ glyxin tất các axit amin mà ta vừa nghiên cứu đều có nguyên tử cacbon bất đối trong phân tử của chúng (C*) và vì thế chúng đều có khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng hay chúng đều là những chất hoạt quang. Các axit amin hầu hết chỉ có một nguyên tử cacbon (C*) bất đối nên chỉ có hai đồng phân quang học (D - L). Hầu như tất cả các axit amin có trong thành phần protein đều có cấu hình L ở nguyên tử C*. Các axit amin có cấu hình D rất ít gặp trong thiên nhiên. Chữ L cho ta biết cấu hình của phân tử, chứ không cho ta biết hướng góc quay của mặt phẳng phân cực của ánh sáng. Còn dấu (+) hay dấu (-) cho chúng ta biết mặt phẳng quay theo chiều thuận hay chiều nghịch của kim đồng hồ. Để phân biệt cấu hình D và L người ta lấy chất chuẩn để so sánh là serin: (D) (L) 2.1.2.2.2 Tính chất lưỡng tính của axit amin Trong cấu tạo của axit amin vừa đồng thời có nhóm amin (-NH2) thể hiện tính bazơ, vừa có nhóm cacboxil (-COOH) thể hiện tính axit nghĩa là chúng mang tính chất lưỡng tính và có thể phân ly thành ion H+ và ion OH-. Trong môi trường nước các axit amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực, có nghĩa là đồng thời mang điện tích âm do nhóm cacboxyl tồn tại ở dạng COO – và mang điện tích dương do nhóm amin tồn tại ở dạng NH3+: R – CH – COOH H2O R CH COO - NH2 NH3+ Dựa trên những nghiên cứu về quang phổ khuyếch tán tái tổ hợp của axit amin trong những năm gần đây, người ta đã xác nhận rằng phân tử axit amin không có nhóm cacboxil tự do cũng như không có nhóm amin tự do và chung đều là muối nội có dạng sau: R – CH – COO - R – CH - COO NH3+ NH3 Sự phân ly của axit amin trong môi trường phụ thuộc vào độ pH. R – CH – COO - (OH-) R – CH – COOH (H+) R – CH - COOH NH2 NH2 NH3+ (Chạy về cực dương) (Chạy về cực âm) - Dựa vào những đặc điểm này, người ta có thể tách các axit amin riêng biệt nhờ dòng điện, đó là nguyên lý của phương pháp điện di. - Khái niệm về điểm đẳng (bằng) điện của axit amin: là tại trị số pH nhất định thì số điện tích âm bằng số điện tích dương có nghĩa là tại trị số pH đó axit amin trung hoà về điện và không di chuyển trong điện trường. Tuỳ theo số nhóm carboxyl và nhóm amine trong phân tử aminoacid cũng như tuỳ theo hằng số phân ly của các nhóm này mà điểm đẳng điện pI của các aminoacid sẽ khác nhau. Ứng dụng tính lưỡng tính của aminoacid Nhờ có tính lưỡng tính mà aminoacid có vai trò là chất đệm trong tế bào và trong trao đổi khoáng của cơ thể thực vật. Dựa vào tính chất này để định tính và định lượng các aminoacid trong dung dịch nghiên cứu bằng phương pháp điện di, sắc ký trên giấy, sắc ký cột... Cũng do tính chất lưỡng tính mà các aminoacid có thể tạo muối nội đồng thời với acid cũng như base: R – CH – COOH + HCl R – CH – COOH NH2 NH3+ Cl - hay R – CH – COOH + NaOH R – CH – COONa + H2O NH2 NH2 Ngoài ra phân tử aminoacid còn tạo muối nội với các ion kim loại nặng như Fe2+, Cu2+ , Zn 2+ ,... đặc biệt với Cu 2+. Cấu hình của muối phức này có thể biểu diễn như sau: 2.1.2.1.3. Tính chất của gốc R Vì gốc R có nhiều nhóm chức khác nhau cho nên có thể thực hiện các phản ứng hoá học như chúng đứng riêng rẽ.
Glutamic Glutamat Na
Dựa vào phương trình này mà ta có thể xác định hàm lượng axit amin hoặc hàm lượng nitơ protein.
Có rất nhiều các phản ứng của gốc R và chính vì thế mà đã tạo cho protein có tính muôn màu muôn vẻ, mang đặc tính đa chức năng đồng thời mang tính đặc hiệu điển hình. Ngoài ra gốc R còn thể hiện tính phân cực và không phân cực làm cho trong dung môi các phân tử này tạo ra vùng kị nước và vùng ưu nước. 2.1.2.1.4. Phản ứng Ninhydrin Căn cứ vào lượng R – CHO, CO2 thoát ra mà ta có thể tính được lượng axit amin. Nhưng thường thì người ta dựa vào cường độ màu của phản ứng tiếp theo để tính toán. Idandion – 2 – N – 2 – Idanon Hợp chất này hỗ biến thành dạng enol và kết hợp thêm với một phân tử NH3 thứ hai : Muối amôn Muốn amôn ở dạng enol của hợp chất này có mầu tím đỏ khá đậm. Trong những giới hạn nhất định, cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng amoniac tham gia trong phản ứngvà do đó tỷ lệ thuận với lượng axit amin ban đầu. Sản phẩm này có khả năng kết hợp với các ion kim loại như Cu2+, Cd2+ ... để tạo thành phức có mầu đỏ đậm bền hơn. Phản ứng của axit amin với ninhidrin được sử dụng rất nhiều để định tính và định lượng axit amin nhờ phương pháp sắc ký trên giấy hoặc trên cột nhựa trao đổi ion khi sử dụng máy phân tích axit amin tự động do Spacman, Stein và Moore đề xướng. 3.1.2.2. Peptit Là các chất cao phân tử tự nhiên được tạo nên từ các axit amin thông qua phản ứng trùng ngưng (phản ứng này là phản ứng quan trọng nhất của a.a) VD: Tripeptit : Ala – Pro – Cys Trong cơ thể sinh vật thường tồn tại các peptit tự do thông thường là các peptit có số axit amin trong phân tử nhỏ. Chúng đảm nhiệm một số vai trò chính sau: - Glutation (tripeptide): glutamyl-cysteinyl-alanine: là một tripeptide có chức năng sinh lý quan trọng. Nó được tạo nên từ 1 gốc glutamyl, 1 gốc cysteine và glycine. Hai nguyên tử glutatione có khả năng phản ứng để tách 2H tạo thành 1 disulfide. Đây là hệ thống đệm sulfhydryl, chức năng quan trọng nhất của nó là giữ nhóm SH của enzyme và coenzyme ở trạng thái khử. Glutathione có trong tất cả các cơ thể sống, tham gia vào nhiều phản ứng oxy hoá khử, ví dụ sự giải độc các gốc độc. Ngoài ra trong thực vật glutathione còn là dạng dự trữ và dạng vận chuyển lưu huỳnh ở dạng khử. Trong những loài cỏ có những tripeptide tương tự như glutatione và trong cây họ đậu 1 glutamyl-cysteinyl-alanine được tìm thấy. Oxytocin và vasopressin: Oxytocin và vasopressin là những oligopeptide, chúng có cấu trúc rất giống nhau, đều bao gồm 9 gốc aminoacid khác nhau, trong phân tử có một cầu disulfide. Hormone oxytocin kích thích phần cơ phẳng của ruột già, bàng quang, túi mật và tử cung. Hormone vasopressin ảnh hưởng đến co rút của phần cơ phẳng của mạch máu, làm tăng áp huyết. Vasopressin có vai trò quan trọng trong việc làm đặc nước tiểu. Nếu nồng độ thấp thì động vật có vú thải ra 1 lượng lớn nước tiểu loãng, là một bệnh được gọi là bệnh tháo nhạt. Cách gọi tên peptit: axit amin có nhóm cacboxyl không tham gia phản ứng thì giữ nguyên tên gọi, còn các axit amin khác thì đều đổi vần cuối thành “il”. VD : Tripeptit : Ala – Pro – Cys : alanil – prolil – cystein * Thuyết polypeptit Theo thuyÕt polipeptit th× c¸c protein ®Òu lµ nh÷ng polipeptit khæng lå ®îc x©y dùng nªn tõ hµng chôc hµng tr¨m ®Õn hµng ngµn gèc axit amin cã cÊu tróc phøc t¹p bëi sù hiÖn diÖn cña c¸c gèc R nhê liªn kÕt peptit. Nh÷ng yÕu tè sau ®©y x¸c nhËn ph©n tö protein ®îc x©y dùng theo c¸ch nh vËy: - Trong c¸c ph©n tö protein ë tr¹ng th¸i nguyªn thÓ, ngêi ta ph¸t hiÖn ®îc rÊt Ýt c¸c nhãm amin vµ nhãm cacboxyl tù do so víi c¶ chuçi polipeptit khæng lå cña protein gi÷a c¸c nhãm chøc nµy ®· cã sù liªn kÕt ho¸ häc nµo ®ã. - Khi thuû ph©n tõ tõ theo tõng nÊc ngêi ta thÊy nhãm amin vµ cacboxyl ®îc gi¶i phãng theo tû lÖ nghiªm ngÆt 1 : 1 ®ång thêi thÊy xuÊt hiÖn nh÷ng axit amin tù do. - TÊt c¶ c¸c ph©n tö protein ®Òu cho ph¶n øng mµu Biure khi t¸c dông víi sunphat Cu trong m«i trêng baz¬ (®©y lµ ph¶n øng ®Æc trng ®èi víi c¸c hîp chÊt chøa liªn kÕt peptit). - Ngêi ta ®· tæng hîp nh©n t¹o ®îc protein ®¬n gi¶n lµ Isulin vµ enzim ribonucleaza… - B»ng ph¬ng ph¸p ®å thÞ R¬ngen ngêi ta ®· thÊy ®îc chuçi polipeptit liªn tôc kÌm theo sù ph©n bè c¸c gèc axit amin trong ®ã ®Æc trng cho protein nghiªn cøu. * §Æc tÝnh cña liªn kÕt peptit §é dµi cña liªn kÕt gi÷a C vµ N trong liªn kÕt peptit n»m trung gian gi÷a liªn kÕt ®¬n vµ liªn kÕt ®«i chÝnh v× thÕ mµ liªn kÕt peptit cã kh¶ n¨ng hç biÕn. Nguyªn nh©n lµ do cã sù kÕt hîp gi÷a cÆp ®iÖn tö π cña nhãm cacboxyl víi cÆp ®iÖn tö tù do cña N. Mét m¹ch polipeptit dùa trªn m¹ch c¬ b¶n lµ m¹ch cacbon nit¬ vµ ®îc bè trÝ trªn mÆt ph¼ng cßn nguyªn tö H vµ gèc R ®îc bè trÝ ®Òu vÒ hai phÝa. 3.1.3. C¸c d¹ng cÊu tróc cña Protein 3.1.3.1 CÊu tróc bËc mét Lµ tr×nh tù s¾p xÕp c¸c axit amin trong m¹ch polipeptit trªn mÆt ph¼ng, lµ d¹ng cÊu tróc c¬ b¶n quy ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña loµi. Liªn kÕt c¬ b¶n quy ®Þnh cÊu tróc bËc I lµ liªn kÕt peptit. Sù s¾p xÕp c¸c ph©n tö axit amin trong m¹ch polipeptit tu©n theo hai quy luËt: - Sù t¬ng ®ång vÒ cÊu tróc: trong mét hoÆc nhiÒu polipeptit ngêi ta thÊy cã nh÷ng nhãm peptit gièng nhau ®Æc biÖt lµ c¸c tripeptit, ®iÒu nay nãi nªn kh¶ n¨ng tiÕc kiÖm n¨ng lîng vµ vËt liÖu cña sinh vËt. - Sù thay thÕ t¬ng hç: trong mét ph©n tö polipeptit cã nh÷ng m¶nh peptit t¬ng tù, quy luËt nµy gióp gióp c¬ thÓ sinh vËt cã thÓ t¹o ph©n tö protein thÓ hiÖn tÝnh ®Æc hiÖu. §iÒu nµy chØ cã thÓ x¶y ra víi c¸c a.a khi cã c¸c yÕu tè: + cã cÊu tróc t¬ng tù + cã ®Æc tÝnh sinh häc gièng nhau + cã ®Æc tÝnh di truyÒn gièng nhau VD: Asp Glu Gly Ala Val Leu Việc xác định cấu trúc bậc I của phân tử protein có ý nghĩa quan trọng: - Là bước đầu tiên quan trọng để xác định cơ sở phân tử hoạt tính sinh học, tính chất hoá, lý của protein. - Là cơ sở xác định cấu trúc không gian của phân tử protein dựa vào cấu trúc không gian của các phân tử protein tương đồng. - Cấu trúc bậc I là bản phiên dịch mã di truyền. Vì vậy cấu trúc này nói lên quan hệ họ hàng và lịch sử tiên hoá của thế giới sinh vật. - Là yếu tố góp phần quan trọng trong nghiên cứu bệnh lý phân tử. Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi thay đổi thứ tự aminoacid, thậm chí chỉ một gốc aminocid trong phân tử protein có thể làm thay đổi hoạt tính sinh học, gây những bệnh đặc trưng. Ví dụ điển hình là bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm, là do cấu trúc bậc I của hemoglobin thay đổi: gốc aminocid ở vị trí thứ 6 trong chuỗi β của hemoglobin A (bình thường) bị thay thế bằng gốc aminoacid valin. - Là cơ sở để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hoá học hoặc bằng phương pháp công nghệ sinh học. Frederick Sanger (1953) đã đề ra phương pháp và sử dụng phương pháp này thành công để xác định trình tự sắp xếp các aminocid trong phân tử insulin (polypeptide có hoạt tính hormone). Đến nay rất nhiều protein đã được xác định cấu trúc bậc I. Insulin là protein đầu tiên được tổng hợp bằng phương pháp hoá học vào năm 1966. Ngày nay bằng phương pháp công nghệ sinh học người ta sử dụng E.coli để tổng hợp insulin. 3.1.3.2 CÊu tróc bËc hai Lµ kh¶ n¨ng t¹o thµnh h×nh xo¾n α vµ cÊu tróc xÕp nÕp kiÓu β cña chuçi polipeptit t¹o nªn ph©n tö protein (do Pauling vµ Corey ®Ò xuÊt). - Liªn kÕt peptit n»m gi÷a 2 nguyªn tö cacbon α kh«ng cã kh¶ n¨ng quay tù do, trong khi ®ã hai liªn kÕt kÒ bªn dÔ dµng quay tù do quanh trôc liªn kÕt t¹o thµnh c¸c gãc φ (phi) vµ ψ (psi) chÝnh v× vËy t¹o nªn xo¾n α – helix. CÊu tróc nµy ®îc gi÷ v÷ng nhê liªn kÕt hidro gi÷a nguyªn tö oxy cña nhãm cacbonyl (C=O) vµ nguyªn tö hidro cña nhãm imin ( - NH). Liªn kÕt nµy rÊt linh ho¹t t¹o ®iÒu kiÖn cho chuçi polypeptit cña ph©n tö protein thùc hiÖn ®îc chøc n¨ng sinh häc trong c¬ thÓ. - CÊu tróc xÕp nÕp kiÓu β lµ cÊu tróc theo d¹ng dÝch d¾c (zigzag) gÊp nÕp cña chuçi polypeptit. Khi c¸c ®o¹n m¹ch cña mét chuçi polypeptit hoÆc hai chuçi polypeptit tiÕn l¹i gÇn nhau th× cã sù t¬ng t¸c gi÷a nhãm -CO- vµ -NH- t¹o ra liªn kÕt hydrogen ®¶m b¶o cho sù h×nh thµnh vµ duy tr× cÊu tróc β. 3.1.3.3 CÊu tróc bËc ba Lµ sù s¾p xÕp vµ ph©n bè ë trong kh«ng gian ba chiÒu cña tÊt c¶ c¸c nguyªn tö cña ph©n tö protein, lµ sù s¾p xÕp cña mét hoÆc mét sè chuçi polipeptit vèn liªn kÕt víi nhau b»ng c¸c liªn kÕt ®ång ho¸ trÞ. Mét sè polipeptit cã cÊu tróc bËc ba: mioglobin, hemoglobin, lizosom, ribonucleaza, pepxin... Ngêi ta cho r»ng cÊu tróc bËc ba cña ph©n tö protein ®îc x¸c ®Þnh bëi cÊu tróc bËc mét, v× sù h×nh thµnh cÊu tróc bËc ba ë trong kh«ng gian lµ do sù t¬ng t¸c c¸c gèc axit amin víi nhau th«ng qua c¸c liªn kÕt ion, liªn kÕt kh«ng ph©n cùc, liªn kÕt hidro, liªn kÕt ®ång ho¸ trÞ vµ liªn kÕt quan träng nhÊt lµ liªn kÕt disunfit ( - S – S ). ChÝnh liªn kÕt disunfit nµy ®· duy tr× cÊu tróc bËc ba cña chuçi polipeptit vµ lµm cho ph©n tö protein ë tr¹ng th¸i æn ®Þnh. Sù t¬ng t¸c cña gèc axit amin víi c¸c ph©n tö dung m«i xung quanh lµ lùc chuyÓn ®éng nh»m lµm cho chuçi polipeptit cña ph©n tö protein cã cÊu t¹o ba chiÒu x¸c ®Þnh. C¸c gèc kh«ng ph©n cùc t¹o thµnh c¸c vïng kÞ níc (hidrophobe) quay vµo phÝa trong, cßn c¸c gèc a níc híng vÒ phÝa dung m«i. Ho¹t tÝnh sinh häc cña ph©n tö protein chØ thÓ hiÖn ë tr¹ng th¸i cÊu tróc bËc ba nguyªn thÓ v× c¸c nÕp gÊp cña cÊu tróc bËc ba duy tr× nh÷ng trung t©m ho¹t ®éng cña c¸c enzim ë nhiÖt ®é cao. 3.1.3.4 CÊu tróc bËc bèn Trong c¬ thÓ sinh vËt cã mét sè ph©n tö protein ®îc t¹o nªn tõ mét sè chuçi polypeptit kÕt hîp víi nhau b»ng liªn kÕt phipeptit, tøc lµ b»ng c¸c liªn kÕt hidro, liªn kÕt ion hoÆc b»ng c¸c liªn kÕt kÞ níc. CÊu h×nh kh«ng gian ph¶n ¸nh sù t¬ng t¸c gi÷a c¸c chuçi polypeptit nµy víi nhau ®îc gäi lµ cÊu tróc bËc bèn cña ph©n tö protein. Nh÷ng ph©n tö nµy ®îc gäi lµ ph©n tö protein oligome hoÆc multime, c¸c chuçi t¹o nªn chóng gäi lµ protome. VÝ dô ®iÓn h×nh vÒ cÊu tróc bËc bèn cña ph©n tö protein lµ hemoglobin ®îc h×nh thµnh tõ bèn chuçi polypeptit (2α, 2β) ë gi÷a cã nh©n Fe. C¸c virut bÖnh kh¶m c©y thuèc l¸ lµ mét nucleoprotein ®îc nghiªn cøu nhiÒu nhÊt vÒ cÊu tróc bËc bèn. Nã bao gåm mét vßng xo¾n ARN, ®îc bao quanh b»ng nh÷ng chuçi polypeptit ®îc s¾p xÕp ®Òu ®Æn. 4.1.4. Tính chất của phân tử protein 4.1.4.1. Tính chất lý học 4.1.4.1.1 Trọng lượng phân tử của protein Protein có trọng lượng phân tử rất lớn, từ hàng nghìn đến hàng triệu hoặc lớn hơn, ví dụ trọng lượng của virut bệnh tằm nghệ bằng 916.106...Để xác định trọng lượng của protein người ta thường dùng phương pháp siêu ly tâm (Svedberg) và dựa vào vận tốc kết tầng của các phân tử dưới tác dụng của lực trọng trường người ta có thể tính được lượng của các phần tử này và trọng lượng phân tử của chúng. 4.1.4.1.2 Sự biến tính của protein Trong phạm vi rất hẹp của nhiệt độ và pH, chất xúc tác ... protein có thể hoàn thành những chức năng sinh học của mình. Ngoài phạm vi đó chúng bị biến tính, nghĩa là thay đổi hoàn toàn về tính chất hóa lý sinh học của chúng. Có thể là biến tính thuận nghịch và biến tính không thuận nghịch. 4.1.4.1.3 Tính hấp phụ trên bề mặt của protein Protein có khả năng hấp phụ các hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử nhỏ và các ion trên bề mặt của nó (hoặc giữ chặt các chất này trong lòng phân tử). Nhờ có tính chất này mà protein có thể hoàn thành những chức năng đặc biệt của của mình trong cơ thể sinh vật như vận chuyển các sản phẩm của sự trao đổi chất, hấp thụ và trao đổi dinh dưỡng khoáng ở thực vật... Ngoài ra protein còn có hàng loạt các tính chất lý học khác như tính hoạt quang, tính di động trong điện trường, tính làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng, tính hấp thụ tia tử ngoại ...Người ta dựa vào những tính chất này để định lượng protein trong dung dịch. 5.1.4.2. Tính chất hóa học Tính chất của protein phụ thuộc vào thành phần, số lượng và và trình tự sắp xếp các gốc axit amin trong phân tử của nó. Các gốc R của axit amin rất phong phú và nó cũng quyết định tính chất hóa học của protein. 5.1.4.2.1 Tính lưỡng tính Tương tự như axit amin, protein cũng là chất điện li lưỡng tính, vì trong phân tử protein còn có nhiều nhóm phân cực của mạch bên (gốc R) của axit amin. Ví dụ : nhóm cacboxil thứ 2 của Asp, Glu, nhóm amin của Lys, nhóm guanidin của Arg, imidazol của His, hidroxil của Ser, Thr, Tyr... Trạng thái tích điện của các nhóm này cũng tùy thuộc pH môi trường. Ở một pH nào đó mà tổng điện tích dương và tổng điện tích âm của phân tử protein bằng không, phân tử protein không di chuyển trong điện trường, gọi là pHi của protein. Như vậy nếu protein có chứa nhiều Asp, Glu, pHi sẽ ở vùng axit, và ngược lại nếu chứa nhiều axit amin kiềm (Lys, Arg, His) thì pHi sẽ ở vùng kiềm. Ở môi trường có pH < pHi, protein là một đa cation, số điện tích dương lớn hơn số lượng điện tích âm. Ở môi trường có pH > pHi phân tử protein thể hiện tính axit, cho ion H+, do đó số điện tích âm lớn hơn số điện tích dương, protein là đa anion, tích điện tích âm. Ở trong môi trường pH = pHi, protein dễ dàng kết tụ lại với nhau có thể sử dụng tính chất này để xác định pHi của protein cũng như để kết tủa protein. Mặt khác, do sự sai khác về pHi, giữa các protein khác nhau, có thể điều chỉnh pH môi trường để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. 5.1.4.2.2 Phản ứng thủy phân peptit Các protein khi thủy phân đều cho các a.a, tùy theo mức độ mà nó phân giải hoàn toàn hoặc không hoàn toàn. Các phản ứng này xảy ra thường xuyên trong cơ thể sinh vật. 5.1.4.2.3 Các phản ứng đặc trưng của protein Phản ứng đặc trưng của protein do những nhóm định chức hóa học xác định của chúng như các phản ứng Biure, phản ứng Millon, phản ứng Pauli, phản ứng Adamkievic, phản ứng Sacagrichi ....Trong số các phản ứng kể trên có phản ứng dung để phát hiện sự có mặt của liên kết peptit (Biure), có phản ứng dùng để phát hiện a.a chứa nhân thơm (Xanthroprotic)... 6.1.4.3. Chức năng sinh học của protein 1, Chức năng xúc tác (enzim): Các protein có chức năng xúc tác cho các phản ứng gọi là enzim. Hầu hết các phản ứng của hệ thống sinh học từ đơn giản nhất như phản ứng hiđrat hoá CO2 đến các phản ứng phức tạp như sao chép mã di truyền đều do enzim xúc tác. Khi thiếu enzim, có khi chỉ là một loại enzim xúc tác cho một khâu nào đó của một chuỗi phản ứng hoá học thì cơ thể cũng không tồn tại được. 2, Chức năng vận chuyển: Một số protein có vai trò như những chiếc xe làm nhiệm vụ vận chuyển các chất trong cơ thể . Sự vẩn chuyển các chất trong cơ thể có thể là từ khu vực này đến khu vực khác hoặc là từ tế bào này đến tế bào khác hoặc từ chất này đến chất khác Khả năng vận chuyển oxy của hemoglobin trong máu là một ví dụ điển hình. Do phân tử hemoglobin có cấu trúc đặc biệt nên nó hoàn thành được chức năng vận chuyển O2 đến tế bào |
